4.RNA酶溶液
取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中,分装成小份(1ml,10mg/ml),-20℃储存。
临用前,取RNA酶A储备液,用2×SSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).
5.0.2%
取2ml Triton X-100加入998ml PBS中,充分振荡使其充分混合。
七、杂交用液
1.SSC(Standard Saline Citrate, SSC)
通常配成10×,20×,50×的储备液,如下:
配制:先称取上述两种试剂,溶于约800ml ddH2O中,滴加10N的NaOH,将pH值调至7.0,补足ddH2O至1000ml,加入终浓度为0.1%~0.2%的DEPC,分装后高压灭菌,可室温保存。
该液主要用于配制予杂交液及杂交后的各种洗脱液,以保持一定的离子强度。此外,在用于杂交的湿盒内也常用5×的SSC以保持一定湿度。
2.Denhardt’s液
通常配成10×,50×或100×的储备液
配制:称取上述试剂,溶于800ml左右灭菌ddH2O中,定容至1000ml后,过滤后于-20℃保存备用。
该液用于配制杂交液及予杂交液等。
3.杂交液及予杂交液
※:临用前加;△予杂交液不加
配制:先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合,加入硫酸葡聚糖于50℃促溶,依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装(最好用铝箔将瓶子包好)存于4℃,可达数月。注意,杂交缓冲液在使用前切忌污染。
变性被打断的无关DNA(常为鲑精DNA或鲱精DNA)可在予杂交及杂交前加入。此外,有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份,可根据需要加入杂交液中,上述配方所列只是不可缺少的基本成份。
配制好的杂交液不宜反复冻融,否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50℃,使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.5~2μg/ml,DNA探针浓度为1μg/ml,此外,如使用35S标记的探针,还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)至杂交液及杂交后的洗脱液中。
八、杂交后漂洗溶液
无论用何种标记方法及何种信号显示方法,在杂交后洗脱则是大同小异。在此,归纳几种带有共同性及常用的洗脱液。
该液常用于杂交后的初次洗脱,故离子强度(张力)较高。
该液常用于杂交后的第二次洗脱,离子强度较低,经过上述两套洗脱液洗后,有的还可用2×SSC,10%(0.1%)SDS洗脱。
主要是洗去残留的RNA,降低背景。用于以RNA为探针的原位杂交方法中。