实验二十二 真菌
真菌(fungus)是真核细胞型微生物，可分为单细胞和多细胞两大类，进行有性繁殖或无性繁殖。其种类繁多，分布广泛，绝大部分为腐物寄生，一些对人类十分有利，如发酵饮食，制造抗生素等；少数可引起人类及动植物病害，需加以防治。
由于真菌有特殊形态和结构，因此形态学诊断有一定价值。真菌一般根据形态结构及培养特性即可分类鉴定。必要时，采用生化反应、血清学试验和动物试验来进行鉴别。
真菌的营养要求不高。通常在含有糖类的沙保(Sabouraud)固体培养基上即可生长。但生长较慢，培养基的pH为酸性，大多数需氧，合适的温度为22～28℃，某些深部致病性真菌在37℃中生长良好。
一、真菌的基本形态与菌落观察
通过对真菌培养物镜下染色标本和菌落的观察，认识真菌的菌细胞，菌丝和孢子及菌落的特征(图22-1、2、3、4、5)。
图22-1 菌丝的形态示意图
(a)单纯菌丝 (b)球拍状菌丝 (c)破梳状菌丝 (d)螺旋状菌丝
(e)结节菌丝 (f)鹿角状菌丝 (g)关节菌丝 (h)假菌丝
图22-2 叶状孢子的形态示意图 图22-3 孢子囊孢子形态示意图
(a)芽生孢子 (b)厚壁孢子 (c)关节孢子
图22-4 大分生孢子的形态示意图 图2医学三基2-5 小分生孢子的形态示意图
【材料与方法】
1．白假丝酵母菌革兰染色 取在沙保斜面培养上经37℃培养5～7d的白假丝酵母菌，制成涂片作革兰染色，高倍或油镜检查。
2．白假丝酵母菌厚膜孢子 在消毒玻片上滴加米粉吐温琼脂或玉黍吐温琼脂少许，将白假丝酵母菌接种在琼脂中央，覆盖玻片，37℃培养2～4d，用高倍镜镜检。
3． 新生隐球菌墨汁标本 将新生隐球菌引起的脑膜炎患者脑脊液(或接种于沙保固体斜面培养物)滴于载玻片上，与1接种环墨汁混匀，盖上盖玻片，四周用树脂密封，高倍镜镜检。
4．菌丝和孢子形态 将融化的沙保培养基少许加于消毒载玻片上，待凝后，将曲霉菌种在琼脂中央，覆盖消毒盖玻片，37℃培养1～2d，室温放24h后，棉兰染色，用低倍或高倍镜观察菌丝与孢子。
(1)有隔菌丝——毛癣菌压片或染色片。
(2)无隔菌丝——毛霉菌压片或染色片。
(3)大分生孢子——石膏样小孢子菌或絮状表皮癣菌压片。
(4)小分生孢子——孢子丝状菌或毛癣菌压片或染色片。
【结果】
菌丝和孢子形态观察
1．可见到革兰阳性单细胞菌体、呈卵圆形，大小不等，染色不均，比葡萄球菌约大2～5倍；可见到假菌丝呈藕节状，丛生的芽生孢子呈圆形或卵圆形。
2．白假丝酵母菌体上出芽伸长可形成假菌丝，在假菌丝紧束点上又附着芽生孢子，一些菌丝顶端可见较大、圆形、壁厚的孢子，称厚膜孢子。
3．在黑暗背景上可见多数发亮的单细胞菌体，呈圆形、大小不等，有透明光亮的肥厚荚膜，细胞壁较厚，有些菌体可见从胞壁伸出的圆形芽生孢子。
4．镜下观察时，注意菌丝分枝、交织，有无分隔，及菌丝的特征性表现，如呈螺旋状、球状、梳状、结节状等。大分生孢子壁厚而大，呈梭状或棍棒状，有数个分隔。小分生孢子则较小，单细胞，呈圆形、卵圆形或梨形等。分生孢子位于菌丝末端，该菌丝称分生孢子柄。
5．菌落观察
(1)酵母型菌落——新生隐球菌菌落。呈浅棕褐色，较大，表面湿润光滑，细腻。无菌丝伸入培养基内，类似一般细菌菌落。
(2)类酵母型菌落——白假丝酵母菌菌落。呈现白色奶油状，较大，表面湿润光滑，细腻。有伸长的芽生细胞所组成的假菌丝伸入培养基内，呈树枝状。
(3)丝状菌落——石膏样小孢子菌、铁锈色毛癣菌，瑾色毛癣苗，许兰氏毛癣菌等在沙保培养基斜面上形成丝状菌落。其共同特征为：带有颜色，菌落可呈棉絮状、绒毛状、粉末状，蜡样等。其正面和背面可显示不同颜色，可看到伸向空间的气生菌丝，伸入到培养基内部的营养菌丝。
二、真菌的培养
大多数真菌营养要求不高，37℃条件(深部真菌)或室温(浅部真菌)条件生长较好，在以上温度条件下均可生长的，称双相菌。厌氧，要求弱酸性(pH4.0～6.0)较高的湿度，生长缓慢，一般需1～2W才长成典型菌落。常用的培养基有沙保培养基、麦芽糖培养基、葡萄糖培养基、玉米粉琼脂培养基及血液琼脂培养基等。真菌小培养可以直接观察到生活状态下真菌的完整结构及发育过程，在鉴定上有重要意义(图22-6)。
图22-6 方块法小培养检查 示意图
(a)培养基划块 (b)待检菌株孵育 (c)镜检
（一)真菌小培养
最好在无菌室或接种罩内进行操作。
【材料与方法】
1．用眼科镊子夹取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取融化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰加热后覆盖于钢环上，待冷，小培养钢环即被固定于载玻片和盖玻片之间。
2．用毛细滴管吸取融化之培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。
3．培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。并用无菌棉花轻轻塞住培养钢环的上端孔和侧孔，以利于空气对流。
4．置湿盒内，室温或37℃培养2～3d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等的特征。
5．亦可不用小培养钢环，直接将融化的培养基滴于无菌玻片，待冷凝后从周边接种材料，用盖玻片覆盖后培养，亦可以在显微镜下连续观察。
（二)斜面培养
【材料与方法】
1．将接种针尖弯成L型，挑取培养物材料，接种于斜面培养基中间一点上，并稍微插入培养基内。
2．毛发或皮屑等病理材料或其www.med126.com/wsj/他物品材料，先用75%酒精浸泡数分钟后，再以无菌盐水冲洗数遍，置于斜面上，并适当向培养基内压入。
3．置室温或37℃培养，每2～3d观察一次。
【结果】
注意菌落的形态特点及颜色变化。挑取少许用压片观察镜下菌丝和孢子特征,临床材料若3周不长者，可报告阴性。
三、浅部真菌临床标本检查
浅部真菌病，包括毛发、指(趾)的皮肤等多种癣病。一般取患病组织材料直接镜检。
【材料与方法】
1．标本采集 采集病变部位材料。发癣可用镊子拔取病损部位毛发，残断头发，若带有灰白色菌鞘者阳性率高，皮肤癣可用小刀刮皮肤损害部位的边缘，以获得皮屑。甲癣则可用小刀刮患病指(趾)甲，以获得甲屑。取标本时，最好先用新洁尔灭洗涤患部后，再取标本。
2．标本制作 清洁玻片上加10%NaOH或KOH1～2滴，将标本材料置于其中，加盖玻片，于酒精灯火焰上方微微加热，静置3～5min，以溶解角质使标本透明，轻轻挤压盖玻片后，显微镜观察。
【结果】
在镜下若能看到典型的菌丝和孢子，即为阳性，常可确定癣病，必要时可送培养。例如：
1．黄癣病，发内有粗细一致的菌丝与发长轴平行，分散于发内，有时分隔似关节孢子，可有或无气泡。
2．黑癣菌，发内有大量孢子，呈关节型排列并充满整个发内，因此毛发出皮即断。
3．铁锈色小孢子菌，发外有卵圆型小孢子，直径2～3mm，密集成片；在发内(根部)可见少数细菌丝。
4．足癣趾间皮屑，镜检可见到上皮细胞附有细长的有隔菌丝及链状排列的孢子。
【注意事项】
1．观察菌丝和孢子时，应注意与纤维、表皮细胞、气泡及油点等区别。
2．阴性结果，不能完全排除真菌感染，应反复检查几次。
