实验四 细菌代谢产物的检查
各种细菌具有各自的酶系统，因而在代谢过程中产生的代谢产物也不同。利用这一生物学特性，可以用来鉴别细菌，这种方法称为细菌的生化反应。
一、细菌对糖的分解
（一)糖发酵试验
【原理】
各种细菌具有不同的酶，分解糖的能力不同，代谢产物亦不同。有的不能分解某些糖类；有的分解某些糖产酸(如甲酸、乙酸、乳酸等)产气(如氢、二氧化碳等)；有的则只产酸不产气。因此，可用来鉴别细菌。
【材料】
1．大肠杆菌、伤寒杆菌18～24h斜面培养物。
2．葡萄糖、乳糖发酵管。
【方法】
1．将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种于1支葡萄糖和1支乳糖发酵管。
2．将上述糖发酵管置37℃培养24h后，观察结果。
【结果】
葡萄糖 乳 糖
大肠杆菌 ⊕ ⊕
伤寒杆菌 ＋ －
（二)V-P试验
【原理】
某些细菌如产气杆菌,分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，被氧化为二乙酰，再与培养基内胍基结合，生成红色化合物为V-P (Voges-Proskauertest) 试验阳性。
【材料】
1．V-P试剂。
2．大肠杆菌、产气杆菌18～24h斜面培养物。
3．葡萄糖蛋白胨水培养基。
【方法】
1．分别将大肠杆菌和产气杆菌接种于2支葡萄糖蛋白胨水中。
2．置37℃培养48h后，取出分别加入KOH 1ml和α-萘酚溶液1m1，摇匀，静置5～15min，观察结果。
【结果】
大肠杆菌：－ 产气杆菌：＋
（三)甲基红试验
【原理】
某些细菌如大肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，继而分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，此为阳性反应。若产酸量少或产生的酸进一步转化为醇、酮、醛、气体和水等，则培养基的酸碱度仍在pH 6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。
【材料】
1．甲基红试剂。
2．大肠杆菌、产气杆菌18～24h斜面培养物。
3．葡萄糖蛋白胨水培养基。
【方法】
1．分别将大肠杆菌、产气杆菌接种于2支葡萄糖蛋白胨水中。
2．置37℃培养2～3d后取出，分别滴加甲基红试剂2～3滴，混匀，观察结果。
【结果】
大肠杆菌：＋ 产气杆菌：－
（四)枸橼酸盐利用试验
【原理】
枸橼酸盐培养基中枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源.有的细菌如产气杆菌，可利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚兰由绿色变为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。
【材料】
1．大肠杆菌、产气杆菌18～24h斜面培养物。
2．枸橼酸盐斜面。
【方法】
1．分别将大肠杆菌、产气杆菌接种于2支枸橼酸盐斜面。
2．置37℃培养24h后，观察结果。
【结果】
大肠杆菌：－ 产气杆菌：＋
二、含氮化合物分解试验
（一)靛基质(吲哚)产生试验
【原理】
某些细菌如大肠杆菌、变形杆菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，再与试剂对二甲基氨基苯甲醛反应后，生成红色化合物—玫瑰吲哚，即为阳性。
【材料】
1．吲哚试剂(对www.med126.com二甲基氨基苯甲醛)。
2．大肠杆菌、产气杆菌18～24h斜面培养物。
3．蛋白胨水培养基。
【方法】
1．分别将大肠杆菌、产气杆菌接种于2支蛋白胨水中。
2．置37℃培养48h后，每管加吲哚试剂2～3滴，观察结果。
【结果】
大肠杆菌：＋ 产气杆菌：－
（二)硫化氢产生试验
【原理】
某些细菌如变形杆菌能分解含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸)产生硫化氢。硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐结合，生成硫化铅或硫化亚铁黑色沉淀物即为阳性。
【材料】
1．大肠杆菌、变形杆菌18～24h斜面培养物。
2．醋酸铅培养基。
【方法】
1．分别将大肠杆菌、变形杆菌接种(穿刺法)于2支醋酸铅培养基。
2．置37℃培养24h后，观察结果。
【结果】
变形杆菌：＋ 大肠杆菌：－
（三)尿素分解试验
【原理】
某些细菌如变形杆菌，产生尿素酶，能分解尿素产氨。氨溶于水变成氢氧化铵，使培养基变碱，加入酚红指示剂呈红色，即为阳性。
【材料】
1．变形杆菌、痢疾杆菌18～24h斜面培养物。
2．尿素培养基。
【方法】
1．分别将变形杆菌、痢疾杆菌接种于2支尿素培养基。
2．置37℃培养18～24h后，观察结果。
【结果】
变形杆菌：＋ 痢疾杆菌：－
三、细菌产生的酶
细菌在合成代谢中能产生一些酶，如血浆凝固酶、透明质酸酶、氧化酶等，通过细菌产生的酶试验可以了解其致病作用。
氧化酶试验
【原理】
某些细菌如奈瑟菌和绿脓杆菌，具有氧化酶(靛基酚氧化酶)，能将氧化酶试剂(盐酸甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺)氧化成红色的醌类化合物，即为试验阳性。
【材料】
1．0.5～1%盐酸对二甲基氨基苯胺(或盐酸二甲基对苯二胺或盐酸对氨基二甲苯胺)水溶液。
2．巧克力色培养基。
【方法】
1．将脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌、白色葡萄球菌分别接种肉汤管或巧克力色平板。
2．置37℃培养24h后，滴加新鲜配制的0.5～1%盐酸对二甲氨基苯胺水溶液2～3滴，培养液呈红色，或在固体培养基上，加试剂后菌落出现红色→深红色→紫黑色变化均为阳性。
【结果】
脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌：＋ 白色葡萄球菌：一
【注意事项】
1．此试验应避免含铁物质，因遇铁后出现假阳性。
2．试剂在空气中易氧化，故应新配制，冰箱保存使用不超过2W。
3．若要分离培养脑膜炎奈瑟菌，应在菌落变成紫黑色之前立即转种，否则细菌容易死亡。
四、细菌内毒素的检测—鲎溶解物试验
【原理】
鲎溶解物试验又称鲎试验，是用鲎血液中变形细胞的裂解物作为试剂，检测细菌内毒素(脂多糖)的一种快速、简单、敏感的试验方法。内毒素可激活鲎变形细胞溶解物中的一种酶，此酶活化后可促使溶解物中蛋白质呈凝胶状态。此法可以测出极微量的内毒素(0.1～lng/m1)。常用来检测注射制剂、生物制品、医学招聘网脑脊液、血液等标本中的内毒素。
【材料】
1．鲎试剂(0.1ml冻干品)。
2．测试品(注射剂、血液或细菌培养上清液等)、标准内毒素(国际统一规定大肠杆菌内毒素，含量为0.1～1μg/m1)、蒸馏水。
3．1ml吸管、37℃水浴箱等。
【方法】
1．打开3支鲎试剂冻干品安瓿，各加入0.1ml蒸馏水溶解，编号。
2．3支鲎试剂中分别加入标准内毒素、蒸馏水、测试品各0.1ml，摇匀。
3．垂直放入37℃水浴15～30min，取出。
【结果判断】
1．安瓿倾斜45°，结果记录如下：
+++ 强阳性，呈固体状。
++ 阳性，呈凝胶状，有变形但不流动
+ 弱阳性，呈粘性半流动状。
一 阴性，呈能流动未凝固状。
2．凡结果阳性者，表示内毒素阳性。
