第十二章 其它仪器分析方法简介

第一节  电感耦合等离子体原子发射光谱法

一、概述

电感耦合等离子体原子发射光谱法 (inductively coupledplasma atomic emission spectroscopy ) 是以电感耦合等离子体作为原子化装置和激发光源的原子发射光谱分析法。简称为ICP或ICP-AES。

等离子体是一种由自由电子、离子、中性原子与分子所组成的在总体上呈中性的电离气体，利用高频振荡电流耦合导电气体，形成外观类似火焰的高温电子和离子平衡的电离气体，称为电感耦合等离子体（ICP)。目前，用ICP作光源，激发样品中各种元素的原子或离子进行元素的定性或定量分析，已得到了广泛的应用。

利用电感耦合高频等离子体（ICP)作为原子发射光谱的激发光源始于上世纪60年代。Greenfield 及Fassel首先发表了用ICP作为激发光源，进行原子发射光谱分析的研究成果。1975年世界上第一台ICP-AES商品发射光谱仪问世，由于其线性范围宽、具有多元素同时或顺序测定的能力、分析速度快、化学干扰少等优点，广泛地用于地质、冶金、机械等领域。但对某些元素来说其检测限不如石墨炉原子吸收法，使其在医药、卫生、环境、生命科学以及生物材料等方面的应用推广受到一定的限制。九十年代以来，ICP-AES的研究取得显著成绩。如水平(端视)ICP-AES的出现，中阶梯光栅与固体检测器的结合使用，使ICP—AES法的检测限得到很大改善，一些元素的检测限甚至低于石墨炉原子吸收法，从而成为多元素痕量分析主要方法。ICP-AES在卫生检验中应用广泛，如美国已将ICP-AES法作为水与废水分析的标准分析法。

二、ICP-AES的基本原理

（一)ICP的形成

ICP焰炬装置由高频发生器和感应线圈、炬管和工作气体三部分组成。炬管的结构如图12-1所示。高频发生器的作用是产生高频磁场以供给等离子体能量。应用最广泛的是利用石英晶体压电效应产生高频振荡的发生器，其频率和功率输出稳定性高。频率多为27~50 MHz，最大输出功率通常是2~4kW。感应线圈由高频电源耦合供电，当高频电流通过感应线圈时，产生垂直于线圈平面的高频磁场。采用特斯拉（Tesla)线圈放电“引燃”氩气，使之发生部分电离。电离产生的离子和电子在高频磁场和由电磁感应而产生的高频电场的共同作用下作形成涡流，并在运动中与氩气原子相互碰撞，使它们进一步电离，使电子和离子的密度急速增大，在炬管口形成等离子体。强大的感应电流产生高温，瞬间使氩气形成温度可达10000K的等离子焰炬。炬管是由三个同轴的石英管组合而成(图12-1)，三个管内均通入氩气，外管通入氩气用以冷却炬管壁，并使等离子体炬离开炬管口，以免烧坏炬管，同时也起稳定等离子体炬的作用；中间管通入氩气用以点燃和维持等离子体炬；而内管通入的氩气作为载气，用以携带试样进入等离子体炬。工作气体一般要求不与样品组分发生化学反应、不因分子离解而消耗能量、谱线简单并具有良好的激发性能。因此常采用氩气

图12-1  ICP炬管的结构示意图

（二)ICP发射光谱的产生

用ICP-AES法测定样品时，常用溶液进样、气化进样和固体进样等方法将待测试样导入ICP装置，并通过炬管的内管被载气带入等离子体炬中。试样中各组分在高温热能的作用下，被原子化，能量足够高时原子中的电子会脱离原子核的束缚力，电离成为离子。同时原子、离子外层的电子吸收外界能量，从能级最低的基态跃迁到较高能级的激发态上。处于激发态的原子、离子是十分不稳定的，它会在极短的时间内从激发态跃迁到基态或其它较低的能级，并以辐射的形式释放出多余的能量，经光栅或棱镜分光后，得到的光谱线，分别称为中性原子线和离子线。各种元素各自具有一定波长的特征谱线，由于光谱线的强度正比于试样中待测原子的浓度，所以可以通过测量其强度进行定量分析。图12-2表示试液进入ICP焰后的变化过程

图12-2试液进入ICP焰后的变化过程

三、ICP-AES的仪器装置

  ICP-AES的仪器装置主要由ICP激发光源、进样系统、分光系统、光电检测系统和数据处理系统组成，仪器组成的方框示意图及仪器装置示意图如图12-3、12-4所示。

图 12-3 ICP-AES 仪器组成示意图

图 12-4 ICP-AES的仪器装置示意图

ICP激发光源主要由高频发生器和感应线圈、绕有感应线圈的炬管和供气系统三部分组成。供气系统由氩气钢瓶、压力和流量调节控制装置构成，为炬管的各管路提供压力和流量稳定的氩气气流。高频发生器可产生较高频率和较大功率的高频振荡电流。高频振荡电流的电能通过铜管制成的感应线圈耦合到炬管中的氩气，产生等离子体炬。铜管内要通水冷却。绕有铜管感应线圈的炬管置于具有高频防护功能的炬室内，点燃等离子体炬前，关好炬室门，通过门上的观察窗观察火炬的点燃情况。

在作ICP-AES测定时，试样由进样系统导入，进样方式有溶液进样、气化进样和固体进样，可选择手动进样或自动进样。固体进样可免去样品预处理过程，不使用溶剂，空白值低，有利于降低检测限。但样品粒度要求较高，进样稳定性较差，基体干扰较大。气化进样使待测元素生成气态物质，从而与绝大部分基体分离，降低基体对测定的影响，检测限得到很大的改善，特别适于能生成易挥发气体的元素测定。溶液进样是ICP-AES最常用的进样方式，样品溶液被吸入进样系统后，由雾化器在雾化室中将试样雾化，雾化形成的气溶胶由载气导入等离子体火炬中，大的雾滴则由废液管排出。溶液进样具有进样速率稳定，基体影响小，标准与样品易匹配等优点，已广泛应用于各个领域ICP-AES分析。

试样中的各种元素原子在等离子体炬中经高温激发，发射出具有各自特征的电磁波，经分光系统作色散处理后，形成特征谱线。ICP-AES中的分光系统一般采用各种光栅为色散元件，如最新的分光系统是采用大面积全息光栅等。经光栅分光后的谱线进入检测系统，将光信号转换成了相应的电信号。不同类型的ICP-AES仪器所配置的光电检测系统有所不同，以单狭缝、单个光电倍增管作光电检测器的仪器称为单道扫描型光谱仪，其优点是结构简单，可根据需要任意选定元素和特征谱线进行测定，缺点是一次只能检测一条谱线，对于多组分待测，检测速度较慢。按波长顺序设置多个出口狭缝，每一个狭缝对应某一条特征谱线和一支光电倍增管，可同时测定多个元素，采用这种检测方式的仪器称为多道型光谱仪。多道型光谱仪的优势是检测速度快，但由于通道的数目受光电倍增管的体积和仪器空间所限制，不可能太多；同时通道是预先确定的，一旦确定，很难更改，使灵活性受到很大限制。近年来，推出了全谱直读型ICP-AES仪器。这种类型仪器的光电检测系统采用了先进的新型光学多道检测器，如二极管阵列电荷转移装置（CTD)、电荷耦合器件(CCD)以及电荷注入装置（CID)等光电检测器，可将从紫外到可见区域的全部波长范围的谱线同时检测并转换成电信号，产生的电信号由计算机处理转换为相应的浓度，能在35秒钟内测定73个元素。

四、ICP-AES的应用和展望

自从第一代ICP-AES仪器在70年代初问世以来，ICP-AES已经过了30多年的理论及应用研究，成为科学界公认的理想的元素分析方法。由于早期ICP-AES方法对某些元素如砷、硒、铅的检测限明显不如石墨炉原子吸收光谱法，因而限制了其在各个领域的应用与推广。自90年代以来，ICP-AES仪器不断改进，其检出限得到改善，且价格大幅降低。目前已在医药、卫生、环保、科研、生物材料及临床分析等各个领域得到了越来越广泛的应用。

在食品卫生分析中，Pb、As、Cu、Hg等多种元素为国标规定所必须分析的元素，由于ICP-AES具有可进行多元素同时测定、简便、快速、准确等优点，克服了原子吸收法测定繁琐、费时的缺点，因而在食品分析中应用广泛。但由于食品样品的复杂性，基体效应和光谱干扰严重。因此消除光谱干扰．降低基体的影响成为ICP—AES分析必须关注的课题。

在环境卫生分析中，环境样品中痕量元素的分析尤其是环境中有毒、有害元素的分析一直是卫生检验工作者所关注的课题。水质分析中一般水样可在加入稳定剂后，直接测定。对于含盐高的水样，需要经过样品预处理，如采用配位萃取等方法将待测元素分离富集后测定；对于含有机物多的水样需在测定前用硝酸和高氯酸将有机物分解后测定；对于各种沉积物、粉尘及煤灰等固体样品的分析，可采用固体进样技术或将样品经过分解和制备后，进样测定。

在生物材料检验中，由干样品复杂，直接用ICP-AES分析的样品有限。近年来，随着电热蒸发(ETV)技术、流动注射(FI)技术以及化学蒸气发生(CVG)技术的应用，使ICP-AES的进样系统有了很大的改善，提高了分析灵敏度，ICP-AES在生物材料和临床分析领域的应用也得到推广。毒物分析是卫生检验的一项十分重要的内容。传统的毒物分析往往根据目视判断是否是阳性或阴性。由于实际毒物样品的复杂性，因此容易导致假象，得出错误的结论。ICP-AES作为一种常规的分析技术，对金属元索具有良好的选择性。因此将ICP-AES应用于毒物分析具有准确、快速的优点。

为了进一步提高分析测定的灵敏度，消除基体影响和谱线干扰，近年来，相继出现了一些将ICP与其它一些分析手段联用的技术，并推出了新的仪器装置，例如电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)、电感耦合等离子体原子荧光光谱仪(ICP-AFS)、傅里叶变换等离子体原子发射光谱仪(ICP-FT)、色谱-ICP-AES等，其中应用最成熟和最广泛的仪器装置是ICP-MS，由于质谱仪的测定灵敏度比原子发射光谱仪更高，同时可克服谱线干扰等一些原子发射光谱的缺点，ICP-MS对大多数元素测定检测限可比ICP-AES低1～2个数量级，具有高灵敏度、高选择性、线性范围宽等优点，也可作多元素同时测定。ICP-MS已被一些发达国家列为无机元素的常规分析手段之一。  

  （高希宝)

第二节 流动注射分析法

流动注射分析法 (flow injection analysis, FIA) 是丹麦学者Ruzicka和Hansen于1975年首次提出的，是一种溶液快速连续分析技术。与建立在平衡体系基础上的分析方法不同，FIA是把试样溶液直接以“试样塞”的形式注入管道内试剂流中，在物理和化学非平衡动态条件下进行测定的分析方法。该法具有分析速度快、分析精度高、仪器设备简单、操作方便和试样用量少等优点，易于自动化，已在卫生检验、环境保护和临床医学等领域得到广泛应用。

一、流动注射分析法的基本原理

(一) 流动注射分析的基本流程

流动注射分析装置如图12-5a所示，包括：蠕动泵（P)，用于驱动载流流动；样品注入阀，用于可重现地将一定体积的样品（S)注入载流；混合反应器（L)，样品在其中分散并与载流中试剂反应，生成可检测的产物；检测器（D)，用于检测反应产物，产生响应信号；记录仪，用于记录响应信号随时间的变化曲线。

图12-5  FIA流程和输出记录曲线示意图

FIA分析过程是将一定体积的液体样品间歇性地注入到一定流速的载流（反应试剂或蒸馏水)中，注入的样品由载流携带以“试样塞”的形式向前匀速流动。由于对流和分子扩散作用，“试样塞”被载流分散成具有一定浓度梯度的试样带。在反应器中，试样带中的被测组分与载流中的试剂发生化学反应，生成可供检测的产物，被传送到检测器进行检测。连续记录检测信号（如吸光度、电极电位、荧光强度等)，得到一峰形信号曲线，如图12-5b所示。一定条件下输出信号峰的峰高H或峰宽W或峰面积A与被测物浓度有关，可作为定量分析的依据。

在FIA中，载流的作用一是推动“试样塞”进入反应管道及检测器；二是尾随试样带自动清洗反应管道和检测器，为下一个试样的检测做好准备。FIA系统所独有的自动、简单、快速的清洗方式，是其分析速度快的主要原因。

如图12-5b所示，从注入样品到峰值出现的时间称为留存时间，用T表示。在留存时间内试样与载流试剂之间同时发生了两个动力学过程。一是试样在载流中的物理分散过程；二是试样与试剂发生化学反应过程。了解这些过程的机制有利于优化流路设计，提高采样频率，降低消耗，充分利用化学反应，提高灵敏度。

(二) 物理分散过程

注入的试样除随载流流动外，在载流中还发生了“对流”和“分子扩散”两种物理过程，总称为分散过程。

1．对流  液体缓慢流过导管时，流体截面各处轴上流速是不相同的，由于层间摩擦力作用，管壁附近部分流速慢，管心部分流速快，自身形成“对流”。对流导致试样带形成长长的拖尾（见图12-6 a)，引起试样带之间发生交叉污染。

2．分子扩散　溶液内存在浓度差时，分子从高浓度向低浓度方向的迁移现象称为分子扩散。由于对流，造成了导管内同一截面上试样分子浓度不同，将发生径向分子扩散（图12-6 b)，试样带中B点的分子将向管壁附近扩散，而A点分子将向管中心扩散。这种分子扩散对于对流起了修正作用，因此，试样在载流中物理分散过程的总结果如图12-6 c所示。

图12-6 FIA中对流与分子扩散示意图

物理分散程度直接影响信号曲线的峰形。主要影响因素有：载流流速、进样方式、管径、留存时间和扩散系数等。其中影响最大的是载流流速，流速快，对流加大，峰宽增大。但实验中保持条件相同时，其物理分散过程都是重复的。

3．分散系数  Ruzicka提出用分散系数（dispersion coefficient)来描述试样带在载流中的物理分散程度，可表示为

（12-1)

式中，D—分散系数，c₀—分散前样品溶液原始浓度(mol/L)，c_max—分散后通过检测器时样液最高浓度(mol/L)。分散程度可分为三种：D=1～2时，为低分散度；D=3～10时，为中等分散度；D＞10时，为高分散度。分散系数是FIA系统的重要参数，应根据不同的分析目的和检测方法，选择不同的分散系数。

(三) 化学反应过程

绝大多数FIA是基于化学反应。在反应器中，样品中待测组分与载流试剂发生化学反应生成检测器可响应的反应产物。在留存时间内产物浓度愈大，检测信号愈强。但在FIA中，化学反应过程是进行不完全的或非平衡的，因此动力学因素影响很大。若发生的反应为

那么在样品带中，随着时间的推移，样品组分A的浓度、载流试剂R的浓度和反应产物P的浓度均在不断变化，其变化情况如图12-7所示。可见产物P的浓度在一定时间后可达到最高点P_max，为了获取最大灵敏度，一般选用P_max所对应的时间为留存时间T。最佳留存时间需经实验筛选优化，一般通过选择反应器管道长度，改变各种试剂流量来确定，有时甚至采用停流技术来达到最佳化。

图12-7组分A、试剂R、产物P的浓度在FIA中的变化曲线

二、流动注射分析的装置

流动注射分析的装置一般由载流驱动系统（蠕动泵)、进样阀、混合反应器、检测器和记录系统组成。

(一)载流驱动系统

蠕动泵（peristaltic pump)的作用是输送载流试剂溶液和试样溶液，是FIA的心脏部件。蠕动泵要求：保持恒定的载流流速，流速不受粘度变化或其他阻力的影响；能瞬时停止和启动，便于精确控制；泵的内体积小，清洗时间短。

常用的多滚筒式蠕动泵工作原理如图12-8所示，沿着压板圆周方向转动的一系列滚筒不断挤压富有弹性的塑料软管，当每个滚筒向前滚动时，两滚筒之间的塑料软管在两个挤压点之间会形成负压，由此将液体抽吸或提升，使液体在软管内连续流动。当滚筒的滚动速度一定时，管内液体的流动速度也将恒定。

图12-8蠕动泵工作原理示意图

蠕动泵可分为单道蠕动泵和多道蠕动泵。多道蠕动泵能够按各管内径的比例泵出液体，所以也称为比例泵。蠕动泵的软管材料大多采用Tygon塑料制成，可用来输送蒸馏水、稀酸、稀碱溶液等。如果需使用浓酸和有机溶剂作截流时，则应使用Acidflex材料的泵管。

除蠕动泵外，还可以采用柱塞往复泵或高位瓶来输送液体。

(二) 进样阀

在FIA中，试样溶液必须以完整的“试样塞”形式注入载流中，试样与试剂间的混合完全由运动中受控制的扩散与对流过程来实现，因此，进样过程中必须避免试样与试剂混合。进样时要求：①注入的试样应当“嵌入”载流，形成完整的试样带；②注入试样体积重现性好；③进样器的死体积小；④注入试样时对载流的流动状态干扰小。

目前广泛使用旋转式进样阀。该进样阀有两个操作位置：采样位置和进样位置。其工作原理如图12-9a所示，由一个带有定容腔的转子和旁路管道组成，当进样阀旋转至采样位置（如图中垂直方向)时，载流由旁路管道流过，以保持FIA系统载流的连续流动，而试样充满定容腔。当进样阀旋转至进样位置（如图中水平方向)时，因旁路管阻力较大，载流将经阻力较小的定容腔流过，同时将一定体积的试样（S)带进反应系统。

图12-9 旋转式进样阀工作原理及结构示意图

进样阀用有机玻璃和聚四氟乙烯制成，其结构如图12-9b所示，是由两个定子（1、3)和一个夹在两个定子中间的转子（2)所组成，通过中间轴将三者相对固定，其中转子可在一定角度转动。转子上有一个定量孔，当转子转到采样位置时，试液由上面定子的进样口（4)注入定量孔，多余的试液从下面定子的出口（5)排出，当转子转动到进样位置后，定量孔与试剂载流接通，试样被载流带入反应系统中，完成进样。

为了满足各种不同分析要求，现已设计制造出多通道、多功能进样阀，以及各种自动进样阀，这些进样阀的基本原理、作用及注入方式基本相同。

(三)混合反应器(mixing reactor)

注入的试样在载流中进行控制性的分散，以试样带的形式由载流带入混合反应器，在混合反应器中试样与载流中某些试剂发生化学反应，形成可被检测的物质。在FIA中，混合反应器实际上是连接进样口和检测器之间的管道，因此又称为“管式反应器”。

反应器管内径一般为0.4～1.0mm，最常用为0.5mm。管内径过大会增大扩散，使单位时间内允许分析的样品数减少；管内径过小则易堵塞，系统阻力大。管道长度应根据分析对象而定，试样与试剂反应慢者应使用较长的反应器管道，反应快的可使用较短的反应器管道。

管式反应器类型主要有直管反应器、盘管反应器及编织反应器等。盘管反应器又称反应盘管，将内径为0.3～0.8mm的聚四氟乙烯细管盘绕在外径为3～5cm的圆筒上而制成，它可以减少“试样塞”的轴向扩散，从而提高进样频率和测定灵敏度。反应盘管应该固定在支持物上，尽量减少几何形状的变化，以避免流动状态变化，影响方法的精密度。编织反应器是由塑料细管按一定方式编织而成。编织反应器中截流的流动方向是在三维基础上变化，所以有较强的限制轴向分散的功能，不仅用于反应管，而且还用于采样环或传输管道。

单珠串反应器的反应管内填充有玻璃球（直径约为反应管内径的60%～80%)。此反应管内“试样塞”的分散程度很小，比同规格直管反应器小十倍左右。当反应管总长为1.5m左右，内径约为0.6mm时，采用普通蠕动泵作载流动力，其管道内可以容纳2～3个试样带而无交叉污染。

(四)检测系统

能用于FIA的检测器种类多，适用于不同的分析目的，这正是FIA适用性强的特点。检测器要求噪音水平低、线性范围宽、响应速度快和灵敏度高等。应用最多的是光学检测器和电化学检测器。

1．FIA光学检测器 FIA中光学检测法常有光度法、荧光法、化学发光法、火焰原子吸收法和电感偶合等离子体光谱法。后两种与FIA联用时较为方便，只需将通向雾化器的管道与反应器管连接即可。常用的光学检测器是带有流通池（流通式液槽)的紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计或化学发光仪。流通池应避免死角，以防止载流试液滞留和截留气泡，影响方法重现性。通常流通池的光径为10mm，内径为1.5mm，充液体积为18μl。

快速扫描光电二极管阵列检测器应用于FIA，与专用计算机联用，形成了连续自动同时测定多组分的分光光度法分析系统，有效拓宽了FIA的应用范围。

2．电化学检测器  电化学检测器应用较多的是离子选择性电极检测器，喷流式电极是最早应用于FIA的电极之一。选择好指示电极与参比电极，将二者插入倾斜一定角度放置的喷流式池内，试样溶液通过导管喷出，先流经上方的指示电极，再流到已浸入流出液中的参比电极。调节排液管高度来控制流出液液面并保持恒定不变。若同时插入几种指示电极，可同时测定多种组分，方法简便快速。

使用离子选择性电极检测器时，并未达到稳定的电极电位，这须严格控制电极表面的试液量及流过的时间在每次测量中都完全一致，才能达到很高的分析精度。选择使用响应快速的离子选择性电极，可以提高方法灵敏度，降低检出限。

(五)记录系统

流动注射分析中检测器的输出信号一般由记录仪记录，记录仪装有自动记录和数字显示装置。典型的FIA输出信号是尖形峰，一般情况下，峰高与待测物浓度成正比，作为定量分析的基础。随着计算机技术的发展，流动注射分析与计算机技术联用，由计算机进行操作控制，可直接记录图谱、收集信息和处理数据，使流动注射分析法自动化程度大为提高。

三、流动注射分析法的应用

1.流动注射分光光度法 流动注射分光光度法是FIA应用最广泛的领域，表12-1为列出了部分应用实例。

表12-1  流动注射分光光度法应用实例

2.流动注射化学发光法 应用固定化酶填充反应器技术，结合化学发光反应，FIA普遍用于生化检测。表12-2列举某些应用实例。这种方法既能保持酶反应的高度选择性，又能通过将昂贵的生物酶固定化后重复使用，降低成本。

表12-2   固定化酶FIA应用实例

四、流动注射分析法的特点

FIA技术发展非常迅速。其特点有：①分析速度快，效率高，一般可达100～200份/h；②精密度高，相对标准偏差在1%左右；③设备简单，条件较好的实验室可以自行组装；④试样用量少，单次进样一般为数微升或数十微升；⑤自动化程度高，条件控制和数据处理都可由计算机完成，可大大减轻劳动强度；⑥适应性强，能与多种检测技术结合；⑦应用广泛，易于推广，在卫生检验、临床化学分析和环境科学领域中具有广阔的应用前景。

（李贵荣)

第三节 化学发光分析法

利用化学反应所产生的分子发光现象建立起来的分析方法称为化学发光分析法(chemiluminescenceanalysis)。某些物质分子吸收了化学反应产生的化学能而被激发，受激分子由激发态回到基态时，发射一定波长的光，这种现象称为化学发光。根据发射光的特征和强度可对该物质进行定性定量分析。化学发光与光致发光不同的是，发光时不需要外辐射源。

一、基本原理

（一)化学发光反应及激发态分子的产生

化学发光反应的产生必须满足三个条件。第一反应必须是自发的（⊿G＜0)并放出足够的能量以产生激发态分子。反应放出的能量必须满足:

其中为化学发光反应的焓变；为受激分子发出光的波长。一般≥170~300kJ／mol，才能在可见光范围观察到化学发光。通常氧化还原反应所释放的能量介于其中，因此，大多数化学发光反应为氧化还原反应。第二，必须有利于形成激发态分子的反应历程。第三，激发态分子去活化过程必须是以光子发射释放能量。

某些化学反应能释放出足够的能量使反应的中间体或产物或受体分子由基态跃迁至激发态，激发态分子释放出光子，产生化学发光，其过程可表示如下：

其中A是产生化学发光的母体反应物，B是参加发光反应的其它反应物，I是中间体，P是产物，F是受体分子。前两种反应历程也表明发光组分可以是中间体也可是反应产物。第三种反应历程中F不是化学反应的参加者而是化学反应释放能量的受体分子，受体分子F获得能量后处于激发状态然后再释放出光子，这种情况被称为增敏化学发光。

（二)化学发光强度与浓度的关系

化学发光的光量子效率()取决于受激分子的生成效率()和受激分子的发光效率()，前者为后两者的乘积。受激分子的生成效率是产生受激分子占母体反应物分子的份额，受激分子的发光效率则是发射出的光子数占受激分子的份额。

化学发光的光量子效率()定义为：

  (12-2)

式中：N_a为阿伏加德罗常数。

由式12-2可见，化学发光的光量子效率一定的情况下，反应体系发出的光子数与反应物的量有关。反应物的量又取决于反应速率，因此，一个化学反应体系的化学发光的强度依赖于化学发光的光量子效率和反应动力学。

式12-3给出了t时刻的化学发光强度与发光反应速率的关系：

 (12-3)

式中：为t时刻的发光强度(光子／秒)；为分析物的反应速率(即化学发光物母体的消失速率，单位为反应分子数／秒)；为化学发光的光量子效率。

在将反应物混合后，由于化学发光物母体的不断消耗，化学发光强度将随反应时间而衰减，化学发光强度随反应物混合时间变化的关系曲线如图12-10所示。

图12-10   化学发光强度随反应物混合时间变化的关系曲线

当化学发光反应的实验条件确定时，在一定的浓度范围内，最大发光强度与待测物的初始浓度成正比，其关系可表示为：

   （12-4)

式中：C为待测物的浓度(mmol／L)；K在一定实验条件下是一个常数；为最大发光强度。

（三)化学发光的影响因素

化学发光的分析性能受所有参与化学反应的组分和发射组分的发光特性的影响。控制化学反应条件是十分重要的。影响化学发光的主要因素有化学反应速度、反应试剂混合速度和发光增敏剂。

1．反应速度  化学发光强度在一定条件下与化学反应速度成正比。如果反应速度慢，发生微弱慢发光，则几乎测不到光的信号。对同一个反应体系，如果能改变反应条件加快反应速度，发光能在瞬间完成，就可以测到一个较强的信号，化学发光分析的灵敏度与反应速度直接相关。影响反应速度的因素诸如温度、浓度、pH、竞争反应、共存物质的催化或抑制作用等都会影响发光分析。

2．混合速度  化学发光的强度在反应开始时逐渐增加，这是由于试剂混合需要一定时间或反应处于诱导期，达到最大值后信号开始下降，这是由于试剂的消耗和化学发光的光量子效率随时间改变引起的。混合速度影响化学发光反应过程动力学，也就影响体系的反应速度，最终影响到化学发光的强度，因此，在化学发光分析检测时必须严格控制反应体系的混合速度和混合方式，以确保化学发光反应体系的稳定。

3．发光敏剂  在化学发光反应中加入某种发光增敏剂，可使发光体系的发光强度大大增加，且发光衰减缓慢，增加了发光检测的灵敏度和特异性，提高了检测的稳定性。常见的发光增敏剂有卤酚类，如对碘苯酚、对溴苯酚等；萘酚类，如-萘酚、-溴--萘酚等；酚代用品，如对碘基苯酚，胺衍生物类，如3-氨基荧蒽，以及6-羟基苯并噻唑衍生物类，如虫荧光素、脱氢荧光素等。例如用辣根过氧化物酶(HRP)标记生物大分子，H₂O₂作氧化剂，在鲁米诺-HRP-H₂O₂体系中加入发光增强剂对碘苯酚，能使发光强度增大1000倍以上。

二、化学发光测量仪器

（一)化学发光仪的主要部件

化学发光仪主要由三部分组成：样品室(即反应室)、检测系统、信号处理系统，其示意图见图12-11。

图12-11化学发光仪示意图

1．样品室 样品室也称流通池，其作用是提供化学发光物质的反应室。样品室必须置于密封的暗室中，以便有效地隔离任何杂散光，避免对检测信号产生干扰。样品室与光电倍增管之间应设有保护光电管阴极的快门，并配有精密的加样器。加样器准确与否直接影响到分析结果，常用的加样器有间歇加样器或断流加样器和流动注射加样器（见图12-12)等。另外样品室必须便于清洗或更换，以避免样品检测时交叉污染。

图12-12 间歇加样器和流动注射加样器

2．检测系统 检测系统主要包括光电倍增管和负高压电源。。在化学发光检测中光电倍增管的测光方式有直流方式和交流方式两种。交流方式也就是光子计数法，在检测微弱光时将是行之有效的方法。光电倍增管必须安装在干燥并始终处在黑暗的环境中，否则噪声及暗电流将骤增。优质的光电倍增管上附有冷却室，电磁场屏蔽以及高性能的前置放大器等，大大改善了检测性能。光电倍增管的工作电压就是外加在阴极和阳极之间的负高压，一般在500V—1500V之间。工作电压通过一个分压器回路分压到各倍增极。负高压电源的稳定对光电倍增管增益影响很大，所以要求负高压电源稳定性必须优于0.1%。对微弱发光体系，负高压电源稳定性应达0.05％以上，负高压越高光电倍增管的增益越大，发光测量的灵敏度越高。

3．数据处理系统 化学发光仪使用的数据处理方式很多。早期的发光仪采用模拟数据在电表上显示或用记录仪记录，随着计算机技术的迅速发展，给仪器的信号处理带来很大方便，计算机处理内容丰富，速度快，结果准确。

(二) 化学发光仪的类型

化学发光仪按检测器的工作方式可分为二类：直流电压型发光仪和交流光子计数型发光仪。

1．直流电压型发光仪  早期市售液相化学发光仪多为注射进样的直流电压型发光仪，放大器为直流放大。在样品室中快速混合样品和试剂后，测量化学发光强度随时间的变化轮廓。定量分析信号可以用峰高，也可以用混合点开始经过一个固定延滞时间的积分信号或者整个峰的积分(面积)。该仪器最大的特点是仪器简单。

2．光子计数型发光仪  光子计数型发光仪如图12-13所示，在弱发光体系中光电倍增管输出的信号为各个离散的脉冲状态，以各脉冲数作为信号，经脉冲高度甄别器将其与噪声脉冲分离，有很好的稳定性和信噪比，因此有较高的灵敏度和重现性，线性范围宽，特别适合于微弱发光体系定量分析。

图 21-13光子计数型发光仪示意图

三、化学发光分析技术

（一)化学发光体系

在化学发光分析中，发光体系是一个重要的部分。在不断的研究与实践中，人们发现了许多化学发光的发光体系，在生命科学研究领域应用较多体系的有以下几种。

1．鲁米诺发光体系  鲁米诺是最早发现和应用最多的化学发光化合物，传统的鲁米诺发光体系一般由发光剂(鲁米诺、异鲁米诺等)、氧化剂和催化剂组成， 其反应机理如下。

2．吖啶类化合物体系  光泽精是第一个被发现有化学发光性质的吖啶类化合物，现在研究和应用较多的是吖啶类化合物，这类化合物在有Ｈ₂Ｏ₂和ＯＨ^-存在时能迅速产生化学发光。光泽精的化学发光机制为：

  3．其它发光体系  其它类化学发光体系还有咪唑类，苯酚类化合物、芳基草酸酯类以及1、2－二氧环乙烷衍生物等，也己广泛应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作。

（二)测定条件选择

在化学发光分析中影响测定的主要因素有混合方式和混合的时间以及合适的反应条件。

1．混合方式和混合时间

（1)多数化学发光反应有较快的动力学速度，化学发光瞬间消失。对于间歇注样方式的发光仪进样后的混合方式将直接影响测定结果，采用自动进样可以获得更好的重现性。混合方式可以利用进样力，也可以借助磁力搅拌或搅拌器加速混合。为了防止信号损失，混合和测定应同时在光电倍增管的窗前进行。

（2)流动注射进样的混合时间可用混合管到流通池的距离来调节，根据化学发光体系的反应速度选择合适的混合管长度。蠕动泵应尽可能均匀，流速恒定，以保证有效地混合并获得最佳的检测信号。

2．反应条件的选择

（1)缓冲溶液的选择：由于pH值对化学发光反应的发光强度影响很大，对不同的发光体系，通过试验确定最佳pH范围，选择合适的pH缓冲溶液。

（2)发光反应试剂浓度的选择：在发光反应体系和化学发光的光量子效率一定的情况下，化学发光的强度取决于化学反应动力学。参与化学发光反应的试剂是影响化学反应动力学的主要因素，化学发光强度随反应试剂的浓度增大而增大，但必须考虑浓度大时的背景干扰和试剂浪费。因此，在满足分析要求的同时尽可能减少试剂的用量。

（3)试剂纯度：所用试剂应纯化，以减小化学发光的背景发射。

（三)定量分析方法

化学发光定量分析的依据是在一定的条件下发光体系的发光强度与待测组分的浓度呈线性关系，其公式为：

常用定量方法有标准曲线法、直接比较法和标准加入法。均适用于化学发光定量分析，本节不再赘述。

四、化学发光分析的特点及应用

（一)化学发光分析的特点

1．灵敏度高 由于化学发光过程没有其它光源产生的杂散光及背景发射的影响，因此，化学发光分析灵敏度较高。通常的化学发光体系，检测限可达10^-15mol，对于一个具有高量子产率，低本底值的化学发光剂，检测限甚至可达10^-18mol－10^-24mol。发光分析法灵敏度高，使分析单个细胞成为可能。

2．线性范围宽 化学发光分析的动态响应范围有一个很宽的线性范围(3～6数量级)。例如：铬(Ⅲ)催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系测量铬(Ⅲ)线性范围从10^-5-10^-11g／ml。

3．操作简便、快速  流动注射分析(FIA)以快速、精密、操作简便，节省试剂及适应性广而著称，将FIA与高灵敏度的化学发光分析结合，分析速度可达120～200样次/小时，操作简便、快速，在分析监测上的应用也愈来愈广。

4．无放射性 化学发光分析为免疫分析提供了新的手段，即化学发光免疫分析法，化学发光免疫分析法是将化学发光试剂，酶(催化剂)或者荧光物质标记到抗原(抗体)上，通过特异性免疫反应与抗体(抗原)结合后，用化学发光反应测定标记物的化学发光强度，以确定被标记的抗原(抗体)的量，该法以其高灵敏度、无放射性危害，有良好的稳定性，其标记的抗原抗体在-20℃可保存半年到一年左右，实用面宽等特点，克服了放射性同位素的所有不足，已成为放射免疫分析最有力的竞争者。

5．价格低廉 根据化学发光原理研制和生产的发光计，结构简单、操作方便，价格低廉。实验室也可利用各种分光光度计、液体闪烁仪自行改装。当然成型的发光计更为实用。

(二) 化学发光分析的应用

1．无机物分析  利用金属离子对化学发光反应的催化作用或对化学发光反应的抑制作用，是无机物化学发光分析基础。应用鲁米诺发光体系可以测定的无机物有Cr³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Mo、V、W、U、NO、SO、CN^—等。

2．有机物的测定  有机化合物可以有多种形式参与化学发光反应，如被测组分作为反应物、催化剂、猝灭剂、能量接受体等参与化学发光反应。利用化学发光分析已测定了苊、芘、蒽、苯并芘、苯并蒽、儿茶酚胺、去甲肾上腺素和多巴胺等物质。

3．生物医学领域研究  将酶促反应与化学发光反应相偶合，以生物分子作为测定对象，把生物能量转化为化学发光信号而输出，通常称为化学发光生物传感器。该方法利用酶法分析的特效性克服了化学发光分析选择性差的不足，从而使它兼有化学发光分析的灵敏性和酶法分析的专属性。这类传感器中以检测H₂O₂的为主。许多酶能催化底物氧化或还原并产生或消耗H₂O₂， 将这些酶固定化作为接受器，辣根过氧化物酶作为换能器，己广泛应用于生物样品中葡萄糖、脲酸、乳酸、胆固醇、氨基酸、蛋白质、DNA、RNA、胆碱、乙酰胆碱、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤等测定。

化学发光免疫分析法将是化学发光法和免疫分析法结合而建立的一类新方法。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。该方法是用化学发光反应的试剂(可以是发光剂或催化剂等)标记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤(如离心分离，洗涤等)，最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。化学发光免疫分析法广泛用于临床上肿瘤标志物(如：甲胎蛋白、癌胚抗原等)、甲状腺功能(如甲状腺素、游离甲状腺素、三碘甲腺原氨酸等)、生殖内分泌激素(如催乳素、黄体生成素、卵泡刺激激素等)、糖尿病标志物(如胰岛素、血清C肽等)以及皮质醇、总lgE、生长激素（GH)等检测。

（康维钧  李珊)

第四节  毛细管电泳分析法

毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)，又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳兴起于20世纪八十年代，是电泳和现代色谱相结合的产物，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它的出现使分析科学得以从微升水平进入纳升水平。毛细管电泳不仅用于小分子物质分离测定，而且可以解决大分子物质分离分析难题，甚至使单细胞、单分子分析成为可能。

一、毛细管电泳基本概念和原理

（一)毛细管电泳分析系统

毛细管电泳系统的流程示意图见图12-14。毛细管内通常充以缓冲溶液或者凝胶高分子溶液，管的两端插入置放有电极的缓冲溶液中。通过一定方式将样品引入毛细管内，然后施加电场对样品进行分离。分离后的组分由毛细管末端的检测器予以检测。检测信号经放大器放大，再由数据处理系统处理后定性、定量。

图12-14毛细管电泳系统的流程示意图

（二)基本概念

电泳过程基于离子在电场中的迁移，在适当的条件下，不同离子有不同的迁移速率，与色谱相似，其分离过程也是差速过程。毛细管电泳分离模式多样，分离机制各有所不同，现以毛细管区带电泳为代表介绍其基本概念和原理。

1．电泳和淌度 带电粒子在电场作用下于一定缓冲溶液中向电荷相反的方向定向迁移称为电泳（electrophoresis)，单位电场下的电泳速度称为淌度(mobility)。

对于球形离子，在一定介质中，淌度m_e大小与离子的半径r、电荷q及溶液粘度h有关。推导可得：

电场中离子电泳的迁移速度v_e等于电场强度E和溶质淌度m_e的乘积。即：

(12-5)

式12-5表明，当电场强度一定时，不同的离子电泳淌度不同，因而在电场中移动的速度不同。大小相同的离子，所带电荷越多，迁移速度越快；电荷相同的离子，离子半径越小，迁移速度越快。这就是区带电泳分离不同离子的基础。

2.电渗  电渗是毛细管中的溶液在外加电场作用下发生的定向流动的现象。电渗的产生与双电层有关，双电层是由毛细管内壁表面产生的在电场作用下也不迁移的离子或带电基团吸引溶液中相反电荷离子形成。如常用的石英毛细管柱，当pH>3时，由于硅羟基（ºSiOH)的离解，柱内表面带负电荷，这些负电荷吸引溶液中的正电荷离子，使其聚集在自己的周围形成双电层。固液界面存在的双电层使得靠近管壁的溶液层中形成高出溶液本体的“自由”正离子，它们在电场中向阴极迁移，迁移中通过碰撞等作用给溶剂分子施加单向的推力，使之同向运动，因而整个毛细管柱内的溶液形成一个圆筒形的塞流，即如图12-15所示的电渗流(electroosmotic flow，EOF)。

图12-15电渗流示意图

常用的毛细管管材中，除石英和玻璃外，一些有机材料如聚四氟乙烯由于残留羧基，其表面也带负电荷，结果都产生指向阴极的电渗，因而通常情况下电渗流从阳极流向阴极。毛细管内电渗流的速度可用电渗速度n_EOF表示，单位电场强度下的电渗速度称为电渗淌度(m_EOF)， 它们和电场强度E关系如下：

 (12-6)

计算公式与电泳的淌度公式近似，显然，电渗可看成电泳的特殊形式。由此可见，离子在毛细管电泳中同时受电泳和电渗的作用而迁移，离子迁移的速度应当是两种速度的矢量和，见式12-7：

(12-7)

在毛细管电泳中，电渗速度约比电泳速度大一个数量级，所以能使所有样品组分同向泳动。正离子电泳方向与电渗流方向一致，流出速度最快；中性分子随电渗流迁移，彼此不能分离；负离子电泳方向与电渗流方向相反，流出速度最慢，因此，在检测器可依次检测到阳离子、中性分子和阴离子。

由电场驱动产生的毛细管电渗流与高效液相色谱中由泵压产生的液流不同，它为平头塞状，不会引起样品区带展宽，而高效液相色谱为抛物状流形(见图12-16)。故毛细管电泳具有高柱效和高分离效能。

图12-16电渗流与HPLC流形比较示意图

在毛细管电泳中，电渗流对分离效率有重要影响，对不同分离模式的毛细管电泳有不同的影响，有的须强化，有的须尽可能地克服，或须调节其大小使其更有利于组分的分离。影响电渗流的因素有多种，如缓冲液的离子强度、介质粘度、介质pH、温度、有机改性剂、表面活性剂、中性亲水高聚物及管壁的涂渍等。

3．毛细管的总长度和有效长度  毛细管柱的实际长度为毛细管的总长度，从进样点到检测点的毛细管长度，称为毛细管的有效长度(effective length)。用柱上光度检测，则毛细管有效长度一般比总长度短5~10cm。用柱后检测，其有效长度与总长度相等。迁移时间和淌度由有效长度确定，电场强度由总长度确定。

4．迁移时间 一种溶质从进样点迁移至检测点所需时间称为迁移时间(migration time)，相当于色谱分析中的保留时间t_R ，它等于从进样点到检测点的距离（l)除以迁移速度（v_e)：

  (12-8)

式中，L— 毛细管总长度，V— 外加电压。

（三)谱带展宽和分离效率

毛细管电泳与色谱均为分离分析方法，分离过程均为差速迁移，在功能和结果显示上非常相似，因此可用与色谱相似的理论和方法来描述，如色谱中的塔板理论和速率理论、保留值、分离度等均可用于毛细管电泳中，但由于两种方法的分离原理不同，在应用时须注意它们的差别。

1．柱效能指标

毛细管电泳的柱效能指标可用色谱理论塔板数n和塔板高度H表示：

式中， —半峰宽。

对于柱上检测的毛细管电泳来说，记录器上显示峰最高点时，溶质尚未流出毛细管柱，与色谱法中在柱后检测有区别，因此，用迁移时间代替色谱法中的保留时间，用毛细管的有效长度代替色谱柱的总长度。

毛细管电泳的理论板数n还可以表示为下式：

（12－9)

式中，D —溶质的扩散系数。

由上式可见，提高毛细管两端电压，增加毛细管有效长度有利于提高分离效率。扩散系数小的分子分离效率高，大分子物质较小分子物质扩散系数小，所以毛细管电泳适合蛋白质、DNA等大分子物质。

2．谱带展宽

毛细管电泳谱带展宽与柱内溶液和溶质本身有关，也与进样和检测等柱外因素有关。

(1) 纵向扩散：溶质在毛细管内沿迁移方向的扩散称为纵向扩散。纵向扩散程度可由下式表示：

 (12-10)

式中，s —标准偏差。

在高电场下，纵向扩散由溶质的迁移时间和扩散系数所决定。溶质在毛细管中停留的时间越短，扩散越小；扩散系数小的大分子(如蛋白质、DNA等)比小分子的区带分散程度低。

(2) 焦耳热和温度梯度：电流通过毛细管柱时产生的热称为焦耳热。电压升高将使功率增大、温度上升。由于毛细管壁的散热使得毛细管中心温度高于管壁温度，在毛细管内径向产生温度梯度而引起缓冲溶液的粘度差异从而破坏平头塞状溶质区带，造成峰扩张。为减小峰扩张，采用细内径、粗外径的毛细管，管外涂低热导率的聚酰亚胺，适当降低外加电压，减少缓冲溶液的浓度及对毛细管恒温等措施可以减少温度梯度效应，从而提高柱效能。

(3) 进样塞长度：在进样过程中，如果样品塞长度超过因扩散造成的区带分散，柱效能降低。进样长度一般为毛细管总长度的1％~2％。

(4)吸附：吸附是指毛细管壁对溶质粒子的作用。由于毛细管壁带有负电荷，吸引阳离子溶质，尤其是对大分子的吸附更强烈。吸附对组分峰的扩张及分离影响很大，应尽可能抑制。在尽可能低的pH下分析、增加缓冲溶液的浓度、使用添加剂或对毛细管壁改性处理，可以减少或消除管壁上的电荷而抑制吸附。

(5)电分散作用：样品区带和缓冲溶液的电导差异可以引起各区带中电场强度的变化，从而导致峰形畸变，这种现象称为电分散作用。对于含有淌度范围宽的溶质样品，畸变则特别明显，只有通过缓冲溶液与样品的电导之间的匹配才能消除电分散作用。

3．分离度  是指将淌度相近的组分分开的能力，同色谱法，在电泳图上读出两相邻峰的迁移时间和它们的峰宽（W)，按下式计算：

下标1，2代表相邻两物质，分离度与柱效的关系有如下关系式：

（12－11)

式中，—相邻两组分淌度均值

上式表明，毛细管电泳的分离度正比于两组分的淌度差，还与外加电压、有效柱长与总柱长比等因素有关。

由于毛细管电泳样品区带非常窄，不同溶质微小的淌度差异足以实现完全分离，因而毛细管电泳的分离度很高。

二、毛细管电泳的分离模式

根据毛细管内分离介质和分离原理不同可以将毛细管电泳分为毛细管区带电泳(capillary zoneelectrophoresis，CZE)、毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF)、毛细管等速电泳(capillary isotachorphoresis，CITP)、胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC) 、无胶筛分毛细管电泳（capillary non-gel seivingelectrophoresis, NGCE)、亲和毛细管电泳（affinity capillaryelectrophoresis, ACE)、毛细管凝胶电泳(capillary gelelectrophoresis，CGE)、和毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC)等多种分离模式，CGE和CEC的毛细管内有填充物，前几种模式毛细管内为自由溶液，以下简单介绍几种主要分离模式。

（一)毛细管区带电泳（CZE)

毛细管区带电泳是在电场作用下，溶质在毛细管内以不同速率迁移形成分立的区带而达到分离的电泳技术。CZE的分离机理是基于样品组分荷质比间的差异，毛细管内为缓冲溶液，组分因荷质比不同而得到分离。

CZE是毛细管电泳中最简单、使用最早、也是应用最广泛的一种分离模式，通常被认为是其它分离模式的母体。其特征是用同一种缓冲液充满整个系统，缓冲液里通常会添加一些添加剂来调整分离效果。其在氨基酸、多肽、阴阳离子、有机化合物对映体分析以及蛋白质的纯度鉴定、变体筛选和构象分析等方面有广泛的用途。

（二)毛细管等电聚焦(CIEF) 

毛细管等电聚焦是利用蛋白质或多肽物质等电点（pI)的不同而实现分离的毛细管电泳技术。阴、阳电极槽分别灌入碱性与酸性溶液，把两性电解质和蛋白质样品的混合溶液压入毛细管内，当加上电压后，在电场作用下形成一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度，蛋白质顺着这一梯度迁移到等电点位置，失去电荷而停止迁移，产生一个非常窄的区带，这个过程称为等电聚焦 ( isoelectricfocusing )。不同的蛋白质等电点不同，则聚焦在不同的位置而达到分离。蛋白质若进入不同于等电点的pH区域内，就会带上电荷，在电场力作用下又会迁移到pH等于等电点的位置，所以蛋白质总能聚焦在很窄的区带内。等电聚焦过程可以利用系统电流来指示，当完成聚焦达到稳定状态后，系统电流指示为零。然后通过从毛细管一端施加压力或在一个电极槽中加入盐的方法移动溶质和两性电解质，使已聚焦的蛋白质或多肽区带通过检测器而被检测。

CIEF具有极高的分辨率，等电点差异小于0.01 pH单位的两种蛋白质也可以得到分离，其在蛋白质pI值的测定、异构体的分离等蛋白质分析中有很好的应用前景。

（三)胶束电动毛细管色谱(MECC)

胶束电动毛细管色谱是在缓冲液中加入高于胶束临界浓度的表面活性剂进行修饰的分离技术。在胶束临界浓度以上，表面活性剂（阴、阳及两性离子表面活性剂)分子间的疏水基团聚集在一起形成外层亲水而内层疏水的胶束，内层疏水部分可以结合或容纳疏水组分（如中性分子)，外层亲水部分是带电荷的基团，电场作用下，整个胶束也因电泳作用而以与周围介质不同的速度迁移。在此，胶束相当于液相色谱中的固定相，因其是移动的，所以被称为准固定相(quasi—stationary phase)，而缓冲溶液为流动相。电泳和色谱相结合使MECC分离具有显著特点，不仅可以分离离子型组分，中性组分因和胶束结合而带电荷也可被分离。各组分基于与胶束作用强弱，即和准固定相之间的分配系数不同而得到分离。

胶束电动毛细管色谱已广泛应用于氨基酸、肽类、维生素、有机化合物和环境污染物等的分离分析。此外，在表面活性剂中加入手性中心则可用于手性化合物的分离。

（四)毛细管凝胶电泳(CGE)和无胶筛分毛细管电泳（NGCE)

毛细管凝胶电泳是以装在毛细管内的凝胶作为支持物的区带电泳技术。凝胶是由颗粒网状结构和凝聚在其中的溶剂所组成的物质，具有分子筛的作用，对溶质的电泳迁移过程有阻碍作用，分子越大，所受阻碍越大，迁移速度越慢。因而根据被测组分的荷质比和分子体积不同而进行分离。

CGE中常用的聚合物有凝胶和线型聚合物两大类，其中凝胶有共价交联型(如交联聚丙烯酰胺)和氢键型(如琼脂)，以前者使用最为广泛。CGE柱制备较困难，柱寿命短，随后发展出“无胶筛分”技术，用线性非交联的亲水性聚合物代替高黏度的交联聚合物，如线性聚丙烯酰胺、甲基纤维素、聚乙烯醇等物质，当溶解于水且达到一定浓度即形成动态网络，从而起到分子筛作用，按分子大小分离各组分，此即NGCE分离基础。NGCE方法简单、方便，但分离能力较CGE差。

目前，CGE和NGCE在分子生物学和蛋白质化学研究等方面有较好的应用，如核苷酸纯度分析、特征基因分析、PCR扩增产物分析、DNA限制性片断分析、蛋白质分离分析等。

三、毛细管电泳仪的基本结构

毛细管电泳仪包括进样、分离、检测和数据处理等部分。其基本结构如图12-14所示。

（一)进样系统

由于毛细管内径十分细小，进样体积只有纳升级，所以不能使用液相色谱法的进样方式，采用无死体积进样方法，让毛细管直接与样品接触，借重力、电场力或其它作用力使样品流入毛细管。目前商品仪器最常用的进样方法有静压力进样和电动进样。静压力进样可通过在毛细管进样端加压，或在检测端抽真空，也可采用虹吸作用进样。电动进样是在加电压的条件下，样品组分由电迁移和电渗流进人毛细管中。此外，还有扩散进样，利用浓差扩散原理将样品分子引入毛细管。

（二)分离系统 

分离系统由毛细管、恒温系统、高压电源和缓冲液瓶等组成。毛细管长一般10~100cm、内径25～100mm，管材可以是聚四氟乙烯、玻璃和石英，石英以其杂质少、非氢键吸附少等优点被作为主要使用的材料。在其外壁涂覆聚酰亚胺以增强弹性和减小散热性。温度对溶液粘度有影响，从而引起迁移时间变化，所以，毛细管电泳系统需在恒温条件下使用，常用空气恒温或液体恒温方法，恒温精度可达±0.1℃。为获得迁移时间的高度重现性，须使电压稳定在±0.1％。

（三)检测系统

由于毛细管内径细小和溶质区带体积极微，所以对检测器灵敏度的要求很高。毛细管电泳的检测器最常用的是紫外检测器，一般采用柱上检测（on-column detection),也可以柱后检测。紫外检测器有固定波长、可变波长、二极管阵列和波长扫描等检测方式，其中，后两种检测方式均可提供时间～波长～吸光度值三维图谱，有利于定性和峰的纯度检测等。紫外吸收检测器灵敏度一般为10^-5～10^-9mol／L，其通用性强，可适合大多数有机物的检测。其它还有荧光检测器、激光诱导荧光(Laser induced Fluorescence，LIF)检测器、电化学检测器、质谱检测器等。其中激光诱导荧光检测器不仅灵敏度高，而且选择性好。其灵敏度高达10^-11～10^-16mol／L，可检出单细胞和单分子，但被测物质须先用荧光试剂标记或染色。质谱检测器还可提供被测组分分子结构等信息。

（四)数据记录处理系统 

毛细管电泳仪的数据记录、图谱形式和数据处理方法与色谱仪基本相同。数据处理系统多采用电子计算机及专用软件对分析过程进行实时记录，经数据处理后通过显示器或打印机输出分析结果。

四、毛细管电泳的应用

毛细管电泳技术具有分离效率高、速度快、灵敏、样品用量少、成本低、易于自动化和应用范围非常广泛的特点。特别是近年来毛细管电泳芯片技术的发展，更拓展了它的应用范围。以下举例说明其应用。

1．几种农药的毛细管电泳分离测定  有机磷农药是胆碱酯酶抑制剂, 对人体具有较高的毒性, 因此对它们进行有效快速分析具有重要意义。克百威、水胺硫磷、甲基对硫磷和对硫磷这4 种农药，除了克百威外均难溶于水, 其中甲基对硫磷和对硫磷又为电中性有机磷农药，使用毛细管区带电泳方式难以使其分离, 需采用胶束电动色谱法，加入胶束（十二烷基硫酸钠)增溶, 并使中性化合物的溶质在水相和胶束相间分配系数不同而得到分离。分离谱图见图12-17。

图12-17  土壤中4种农药的毛细管电泳分离图谱

2．有机酸的测定   有机酸测定在食品、生化、环境等领域具有重要意义。传统的离子色谱法通常只能分离测定C2～C4 二元羧酸. 而GC/ MS 法测定虽然十分有效,但是需要繁琐的样品衍生化预处理过程， 毛细管电泳为测定有机酸提供了新的技术选择。图12-18是C1~C8正构羧酸毛细管电泳色谱图。

图12-18　毛细管电泳分离8种有机酸的图谱

1.甲酸，2. 乙酸，3. 丙酸， 4. 丁酸，5. 戊酸，6. 己酸，7.庚酸，8. 辛酸

 (康学军)

第五节　质谱法及其联用技术

一、概述

质谱法（mass spectrometry, MS)是将被测物质离子化，并按离子的质荷比大小进行分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。

1906年英国物理学家J.J.Thomoson发明了质谱，起初只是作为无机化学中研究同位素的分析工具。20世纪40年代以后质谱开始用于有机化合物的分析，发展成为有机质谱。60年代出现了气相色谱-质谱联用仪，使质谱仪的应用领域发生了巨大的变化，开始成为有机物分析的重要仪器。80年代后，由于软离子化技术相继问世及液相色谱-质谱联用仪和质谱-质谱联用仪的发展，使质谱的应用拓展到分析高极性、难挥发和热不稳定样品的范围，应用到生物大分子研究，发展成为生物质谱，并迅速成为现代分析化学最前沿的领域之一。

质谱法具有分析速度快、灵敏度高及可以提供样品分子的相对分子质量和丰富的结构信息的优点，已成为生物和生物化学、食品化学、毒物学、药物学、医学等领域进行分析和科学研究的有力手段，特别是在蛋白质组学研究方面发挥着巨大的作用。

二、有机质谱

（一)有机质谱原理

将气态的样品分子置于高真空中，在高速电子流或强电场的作用下，失去外层电子而生成分子离子（molecular ion)，或化学键断裂生成不同质量的碎片离子（fragment ion)。分子离子是指失去一个电子而带正电荷的分子（用表示，或简写为)；碎片离子是指分子中某些化学键断裂而生成的质量较小的带正电荷的离子。这些离子在质量分析器中按质荷比大小顺序分开，经检测器检测，可得到化合物的质谱图。根据质谱图中峰的位置进行定性分析，峰的强度进行定量分析，以此获得化合物的分子量及其它有关结构信息。

常见的质谱图是经计算机处理的棒图（bar graph)，图中每一个棒（每一条线段)代表一种质量的离子。图12-19是毒鼠强的质谱图。横坐标表示离子的质荷比，纵坐标表示离子的相对强度（或称为相对丰度)。

图12-19　毒鼠强的质谱图

目前，已建立了十几万至几十万个有机化合物标准质谱图的数据库。分析一个未知物，得到质谱图后，可以通过计算机进行谱库检索，查得该质谱图对应的化合物，方便、快捷、省力。但如果数据库中没有此化合物，或得到的样品的质谱图有其它干扰组分，检索结果会出错，此时必须辅助其他定性方法才能确定化合物的结构信息。

（二)有机质谱仪

质谱仪类型各不相同，但仪器的组成都基本相同。电离装置：将样品分子电离为离子；分析装置：使不同质荷比的离子分开；检测器：将离子流转变成电信号。为了获得良好的分析质量，必须避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在和通过的地方，必须处于真空状态。

质谱仪结构如图12-20所示。

图12-20　质谱仪结构示意图

1. 真空系统　高真空系统是使质谱仪正常工作的保障系统。质谱仪的样品导入系统、电离源（离子源)、质量分析器、检测器等主要部件均需在真空状态下工作，电离源真空度应达1.3×10^－4～1.3×10^－5Pa，质量分析器中真空度应达1.3×10^－6Pa。其目的是为了避免电离源灯丝损坏、离子散射、离子与残余气体分子碰撞引起能量变化、本底增高、副反应过多。一般质谱仪采用机械泵预抽真空后，再用扩散泵连续运行保持真空状态，新型质谱仪可用分子泵以获得更高的真空度。

2. 样品导入系统　由于质谱仪的电离源、质量分析器安装在真空腔里，样品只有通过特定的方法和途径才能被导入到电离源，并被离子化，然后被引入质量分析器进行质量分析。完成样品导入任务的部件统称为样品导入系统。将样品导入电离源的方法决定于样品的物理性质，如熔点、蒸汽压等，样品导入方式可分为直接法和间接法www.med126.com/yaoshi/。

（1)直接法：适合于挥发性较低、热稳定性好的样品。将挥发性较低的单组分样品（固体或液体)直接装在探针上，将探针送入真空腔，进入电离源内，然后给探针通大电流加热，使探针的温度急剧上升(一般不超过400℃)。样品分子受热后挥发形成蒸汽，被电离源离子化。直接法是最常用的进样方法，所需样品量很少，一般只需要几纳克样品。

（2)间接法：目前质谱样品导入系统发展较快的是色谱-质谱联用的接口技术，用以将色谱流出物导入质谱，经离子化后供质谱分析。这种进样系统的研究热点之一是质谱和色谱之间的接口技术，将在下面的内容中介绍。

3. 电离源　又称离子源。电离源的功能是将样品导入系统引入的气态样品分子转化成离子。目前质谱仪中，有多种电离源可供选择，如电子轰击电离源、化学电离源、大气压化学电离源、电喷雾电离源及基体辅助激光解吸电离源等。

（1)电子轰击电离源（electron impact, EI)：气化后的样品分子进入离子化室后，受到由钨或铼灯丝（标准工作条件下灯丝被加以70eV的固定电压)发射并加速的高能电子流的轰击，生成分子离子和碎片离子。由于被电离的分子主要生成正离子和少量负离子，因此质谱法主要研究阳离子。在电离源中推斥极的作用下阳离子进入加速区被加速，并被聚集成离子流引入质量分析器，而阴离子和中性碎片等则被真空抽出系统。电子轰击质谱能提供有机化合物最丰富的结构信息，有较好的重现性，其裂解规律的研究也最为完善，已经建立了数万种有机化合物的标准谱图库可供检索。其缺点在于不适用于难挥发和热稳定性差的样品。

（2)化学电离源（chemical ionization, CI)：有些化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子，因而不能用质谱法测定分子量。确定这些化合物的分子量可以采用CI电离方式。EI和CI在结构上主体部件大致相同，主要差别是CI源工作过程中要引进一种反应气体。样品分子在受到电子轰击前，被一种反应气如甲烷、异丁烷等稀释，稀释比例约为。反应气在高能电子流的轰击下首先电离，生成分子离子（一次离子)，和反应气分子进一步作用，生成高度活性的反应离子（二级离子)，再与样品分子发生离子-分子反应，通过质子交换使样品分子电离。化学电离通常得到准分子离子，如果样品分子的质子亲和势大于反应气的质子亲和势，则生成，反之则生成。由CI得到的质谱不是标准质谱，故不能进行库检索；与EI一样，不适用于难挥发和热不稳定化合物的分析。

4. 质量分析器　是将离子源中生成的各种离子按质荷比进行分离的装置。质量分析器的两个主要性能指标是质荷比的范围（质量范围)和分辨率，各类质谱仪的主要差别在于质量分析器，常用的有磁分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器及飞行时间质量分析器等。

（1)磁分析器：又分为单聚焦质量分析器（single focusing massanalyzer)和双聚焦质量分析器（double focusing mass analyzer)。在离子源中产生的离子被电场加速后进入入射狭缝，垂直射入扇形磁场中，偏转后穿过出射狭缝，再聚焦于收集器。离子偏转的曲率半径与离子质量、离子电荷、磁场强度、加速电压有关。离子的质荷比与各参数的关系可表示为：

　　　　　　　 　   （12-12)

由上式可知，进行质谱分析时，在一定的、条件下，不同的离子，其运动半径不同，凡是不能符合式（12-10)要求的离子，不能穿过出射狭缝，符合的离子才能聚焦于出射狭缝处，实现方向聚焦，最后到达检测器。这种磁分析器称为单聚焦质量分析器，结构简单，操作方便，但分辨率很低。为了消除离子能量分散对分辨率的影响，双聚焦质量分析器在入射狭缝与扇形磁场之间增加一个扇形电场（静电分析器)，只有动能与运动半径相匹配的离子才能通过静电分析器实现能量聚焦，然后再进行方向聚焦，经过双聚焦后，分辨率大大提高。

（2)四极杆质量分析器（quadrupole mass analyzer)：由四根平行的、对称放置的棒状电极（长0.1～0.3m)组成。相对两根电极加电压，另两根电极加电压-，其中为射频电压，为直流电压。结构如图12-21所示。当离子束进入电极包围的空间后，受到交、直流叠加电场的作用而波动前进。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子能够作稳定运动通过电场区到达收集器产生信号，这些离子称为共振离子；其他质荷比的离子在运动过程中与电极碰撞而被真空泵抽出系统，这些离子称为非共振离子。若使直流和射频电压振幅按不同比率改变或通过改变射频频率则可实现质量扫描，使不同质荷比的离子依次到达检测器。四极质量分析器的优点是分析速度极快，最适合与色谱仪联用，且结构简单、自动化程度高。

图12-21　四极杆质量分析器

5. 检测器　检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，由质量分析器来的离子流打到电子倍增器上产生电信号，采集的信号经放大并转化为数字信号，计算机进行处理后得到质谱图。质谱离子的多少用丰度（abundance)表示，即具有某质荷比离子的数量。由于某个具体离子的“数量”无法测定，所以一般用相对丰度表示其强度，最强的峰叫基峰（base peak)，其他离子的丰度用相对于基峰的百分数表示。在质谱仪测定的质量范围内，由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。

三、生物质谱

随着生命科学及生物技术的迅速发展，为了解决有关生物活性物质的分析问题而发展了生物质谱。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及后基因组计划的实施。生物质谱是目前有机质谱中最活跃、最富生命力的研究领域，为质谱研究的前沿课题，大大推进了有机质谱分析理论和技术的发展。

生物质谱主要用于解决两方面的分析问题：精确测量生物大分子，如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子量，并提供它们的分子结构信息；对存在于生命复杂体系中的微量或痕量小分子生物活性物质进行定性或定量分析。

近几年来用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术研究得最多、应用得最广泛的主要有二种：电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱（matrix assisted laser desorption ionization massspectrometry, MALDI-MS)。

（一)电喷雾电离质谱

电喷雾电离是一种“软”电离技术，1988年美国科学家John Fenn教授领导的研究组报道了他们运用电喷雾电离质谱（ESI-MS)首次成功地进行蛋白质分析，从此揭开了ESI-MS用于生物大分子研究的序幕。

ESI-MS既可分析大分子也可分析小分子。对于分子量在1000Da（道尔顿，)以下的小分子，会产生或离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检测，就可得到分子量。而分子量高达20,000Da的大分子在ESI-MS中生成一系列多电荷离子，通过数据处理系统能够得到样品的分子量。ESI-MS通过多电荷离子已能测出分子量达133,000Da的蛋白质或分子量达200,000Da的糖蛋白。ESI一般用于四级杆质谱仪，也可用在磁质谱仪上。ESI-MS可进行蛋白质构象分析、酶反应中间体分析、酶抑制剂机理分析、共价或非共价复合体分析等。HPLC与ESI-MS联用可进行蛋白质序列分析。

（二)基质辅助激光解吸电离质谱

1988年Tanaka和Hillenkamp两个研究组分别提出使用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS)进行生物大分子分析。基质辅助激光解吸电离源（MALDI)通常与飞行时间质谱仪联用，也可与四级杆质谱仪及磁质谱仪联用。MALDI-MS分析蛋白质的关键是选择合适的基质，首先基质必须在蛋白质溶剂中有好的溶解性，其次必须能强烈吸收入射的激光，以使能量沉积在基质中而非分析物上。另外在固相体系中能分离和包围被分析分子而不形成共价键。

MALDI谱图中单电荷分子离子峰占绝对多数，碎片离子极少，成为混合物分析的理想手段。MALDI-TOF-MS非常适用于一维或二维电泳分离后的蛋白质样品及它们酶解后产生的多肽混合物，后者所得质谱图结合数据库搜索，对鉴定蛋白质和蛋白组学研究非常重要。

四、色谱-质谱联用分析法

（一)色谱-质谱联用技术概述

联用技术指两种或两种以上的分析技术在线结合，重新组合成一种以实现更快速、更有效地分离和分析的技术。最常用的联用技术是色谱与质谱联用。色谱是一种很好的分离手段，可以将复杂的混合物中的各个组分分离开，但它的定性、定结构的能力较差；质谱对未知化合物的结构有很强的鉴别能力。在这种联用系统中，色谱仪相当于将纯物质输入质谱仪的进样装置，而质谱仪相当于色谱分离产物的检测器。两种仪器通过“接口”（interface)直接联接起来，接口要协调前后两种仪器的输出和输入间的矛盾，使之相互匹配，因此它是色谱-质谱联用技术中的关键装置。

利用色谱-质谱联用技术可获得多种定性定量信息，如总离子流色谱图（total ion current chromatogram, TIC)、选择性离子检测（selected ion monitoring, SIM)、质量色谱图（mass chromatogram, MC)和质谱图等。

TIC是总离子流强度随时间变化的色谱图，其纵坐标为总离子流的强度（每个质谱的所有离子强度的加和)，横坐标为时间，以色谱保留时间和质谱图双重因素对待测物质定性后再定量。此图的外形和由一般色谱仪得到的色谱图是一样的，只是以质谱仪为检测器，同样给出保留值、峰高和峰面积。

SIM指选择质谱图中能表征待测成分的一个或几个质谱峰进行测定的方法。选择一个质谱峰称为单离子检测（SID)，选择几个质谱峰称为多离子检测（MID)。SID适合于复杂混合物某一痕量组分的测定，MID即全扫描工作方式，适用于未知化合物的定性和定量分析，而对目标化合物的寻找应采用多离子检测。

MC是先用全扫描方式进行离子流检测，得到总离子流色谱图，然后对某个特征离子进行计算机处理得到色谱图。

（二)气相色谱-质谱联用技术

　　气质联用仪是分析仪器中较早实现联用技术的仪器，由气相色谱仪、接口、质谱仪组成。气相色谱仪分离样品中各组分，接口把气相色谱流出的各组分送入质谱仪，质谱仪对接口依次引入的各组分进行分析，计算机系统交互式地控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理，是气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)的中央控制单元。

1. 仪器接口　理想的GC-MS联用仪的接口是既能除去全部载气，又能把待测物无损失地从气相色谱仪传输到质谱仪的装置。常用的接口有直接导入型（direct coupling)、开口分流型（open-split coupling)和喷射式分子分离器接口。

　　（1)直接导入型接口：内径0.25～0.32㎜的毛细管色谱柱插入一根金属毛细管中（深入1～2㎜)，金属毛细管直接引入质谱仪的离子源，载气和待测物一起从气相色谱柱流出立即进入离子源的作用场。待测物成为带电粒子在电场作用下加速向质量分析器运动，而载气被真空泵抽走。这种接口方式是最常用的一种技术。

（2)开口分流型接口：气相色谱柱的一段插入接口，其出口正对着另一毛细管，该毛细管称为限流毛细管，将色谱柱洗脱物的一部分定量引入质谱仪的离子源。这种接口结构简单，但不适用于填充柱。

（3)喷射式分子分离器接口：气体在喷射过程中不同质量的分子具有不同的动量，动量大的分子沿喷射方向运动，进入质谱仪，动量小的分子偏离喷射方向，被真空泵抽走。这种接口适用于各种流量的气相色谱柱。

2. GC-MS联用技术的应用　GC-MS联用在分析检测和研究的许多领域中起着越来越重要的作用，特别是在许多有机化合物常规检测工作中成为一种必备的工具。如致癌物的分析、工厂污水分析、农作物中农药残留量的分析、兽药残留量的分析、食品添加剂分析及保健食品功效成分分析等许多色谱仪无能为力的分析课题，GC-MS分析可以发挥独特的作用。

毒鼠强的化学名称为四甲基二砜四胺，其毒性约为KCN的100倍，氟乙酰胺又名敌蚜胺。毒鼠强和氟乙酰胺造成的严重危害已成为近年来社会关注的热点问题，对毒鼠强和氟乙酰胺进行同时鉴定具有重要意义。GC-MS同时测定两种鼠药的混合物，方法可靠实用，简单快速。

分别取毒鼠强、氟乙酰胺及其1∶1混合物进行GC-MS测定。混合物溶液的总离子流图（TIC图)如图12-22所示，TIC图的色谱峰给出氟乙酰胺和毒鼠强的保留时间分别为2.99和12.39min。对样品进行选择离子监测（SIM)，在12.39min处显示出所选择的5个特征离子碎片峰，丰度比与毒鼠强标样的全扫描图一致，证明了样品中毒鼠强的存在。

图12-22　毒鼠强与氟乙酰胺混合标准品的总离子流图

（三)液相色谱-质谱联用技术

对于极性强、挥发性差、分子量大及热不稳定的混合体系，气相色谱-质谱联用技术不适用。但在实际工作中，绝大多数化合物具有上述特征，而这些物质的分离需要采用液相色谱才能完成，因此，液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)得到迅速发展。

液相色谱-接口-质谱仪构成LC-MS联用仪的三大部分。常见的液相色谱是高压-液相-分子的体系，而质谱是高真空-气相-离子的体系。因此，LC-MS联用需要解决的主要问题是接口问题。

1. 仪器接口　从标准孔径HPLC柱出口的流出液，先通过一个分离器，流出液被分离，仅有约5%的流出液被引进离子源内，剩余部分收集在馏分收集器内。当流出液经过接口时，接口将承担起除去溶剂和离子化的功能。

（1)电喷雾接口：带有样品的色谱流动相由液相泵输送到ESI探针，经其内的不锈钢毛细管流出，给毛细管加数千伏的高压，由于高压和雾化气的作用，流动相从毛细管顶端流出时，会形成扇状喷雾，生成带电液滴，经干燥气除去溶剂后，带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器。

　　（2)大气压化学电离接口：色谱流动相带出的液流被强迫通过一根窄的管路使其得到较高的线速度，给毛细管高温加热及雾化气的作用使液流在脱离管路的时候蒸发成气体，通过电晕放电，启动一系列气相反应以完成离子化过程。

2. LC-MS联用技术的应用　LC-MS联用仪是分析分子量大、极性强的样品（如蛋白质等)不可缺少的分析仪器；而且它已在生物化学（多肽、核酸结构分析)、临床医学（某些疾病诊断)、环保、中药研究等领域中得到广泛的应用。

 （茅力)

第六节   红外光谱法

一、概述

红外光谱法 (infrared spectroscopy, IR)又称红外分光光度法。它是利用物质对红外光区电磁辐射的选择性吸收来进行结构、定性和定量分析的一种分析方法。

红外光谱在电磁波谱中位于可见光区和微波光区之间，其波长范围为0.75 ～1000μm。习惯上常根据能量与可见光区的接近程度将红外光区划为三个区域（表12-3)。

表12-3  红外光谱区域

通常所说的红外光谱是指中红外区吸收光谱。它是由於物质分子吸收该区的辐射后发生振动能级和转动能级跃迁引起的。标准红外吸收光谱图一般用波长λ或波长的倒数即波数为纵坐标，以百分透光度T％为横坐标来描述，故其吸收峰顶向下，如图12-24所示。

图12-23  聚苯乙烯的红外光谱图

红外光谱与紫外光谱都属于分子吸收光谱，但红外光谱法有如下特点：

⑴ 红外光谱依据样品在红外光区（一般指2.5～25μm波长区间)吸收谱带的位置、强度、形状、个数，并参照谱带与溶剂、聚集态温度、浓度等的关系来推测分子的空间构型，求化学键的力常数、键长和键角，推测分子中某种官能团的存在与否，及与其邻近的基团，从而确定化合物结构。

⑵ 红外光谱不破坏样品，并且对任何样品的存在状态都适用，如气体、液体、可研细的固体或薄膜似的固体都可以用于分析。测定方便，制样简单。

⑶ 红外光谱特征性强。所以人们也常把红外光谱称为 “分子指纹光谱”。对于一些同分异构体、几何异构体和互变异构体，也可以采用红外光谱进行鉴定。

⑷ 分析时间短。一般在10～30min内可完成一个样品的红外光谱法分析。如果采用傅里叶变换红外光谱仪，在1s以内就可完成多次扫描。为快速分析提供了十分有用的工具。

二、基本原理

（一)分子的振动

红外吸收光谱产生于分子振动能级的跃迁，以双原子分子为例。如果把双原子分子看成是一根弹簧两端连着的质点(原子)，这两个原子以平衡点为中心作振幅非常小的周期性振动，即可看成是简谐振动。根据虎克(Hooke)定律，双原子分子的振动频率可表示为：

 （12-13)

式中，为振动频率（cm^-1)；c 为光速（cm/s)；k 为化学键的力常数(N/cm)； µ 为折合质量（g)。

（12-14)

式中m₁、m₂分别为两个原子的质量。

化学键的振动频率是键的强度(用力常数表示)和折合质量的函数。根据式（12-11)便可以计算分子的振动频率。

【例12-1】  计算O-H键（力常数k=7.7×10⁵ g/s²)的振动频率ν和波数。

解：

(s^-1)

(cm^-1)

从例可知，与氧原子结合的氢原子在伸缩振动时振动频率为1.11×10¹⁴Hz。对不同结构的有机化合物，由于原子对的折合质量和力常数不同，其相应的吸收频率也各不相同，也就产生了具有自己特征的红外吸收光谱。

 （二)  红外吸收光谱产生的条件

分子在发生振动能级跃迁时，需要一定的能量，这个能量通常由辐射体系的红外光来供给。由于振动能级是量子化的，因此分子振动只能吸收一定的能量，即吸收与分子振动能级间隔△E_振的能量相应波长的光线。只有当红外辐射频率等于振动量子数的差值与振动频率的乘积时，才能吸收红外线，产生红外光谱。这是红外吸收光谱产生的第一个条件。  

 红外吸收光谱产生的第二个条件是分子在振动过程中必须有瞬间偶极矩的改变，也就是前面提到的具有红外活性的振动。如CO₂分子的ν_as(不对称伸缩振动)，虽然它的永久偶极矩为零，但在振动过程中，在一个氧原子移向碳原子的同时，另一个氧原子却背离碳原子运动。因此，电荷分布将发生周期性的变化，使正负电荷不重合，产生瞬间偶极矩，结果在2349cm^-1处发生了吸收，而CO₂分子的ν_s，两个氧原子同时离开或移向中心碳原子，两个键产生的瞬间偶极矩方向相反，大小相等，分子的正负电荷重合，对于整体而言，偶极矩没有变化，始终为零，所以该振动不产生红外吸收。

(三)红外吸收光谱中常用的几个术语

1. 特征峰与相关峰

红外光谱的最大特点是具有特征性。复杂分子中存在许多原子基团，各个原子基团（化学键)在分子被激发后，都会产生特征振动。例如CH—NH₂中的NH₂基具有一定的吸收频率，而很多含有 NH₂基的化合物，在这个频率附近（3500 ～3100 cm^-1)也出现吸收峰。因此将凡是能用于鉴定原子基团存在并有较高强度的吸收峰，称为特征峰，其对应的频率称为特征频率。

一个基团除了有特征峰以外，还有很多其它振动形式的吸收峰，习惯上把这些相互依存而又相互可以佐证的吸收峰称为相关峰。如CH₃相关峰有：ν_C-H(as)约2960 cm^-1，ν_C-H(s)（对称伸缩振动) 约2870 cm^-1，σ_C-H（弯曲振动)约1470 cm^-1，σ_C-H(s) 约1380cm^-1（as表示反对称，s表示对称)。用一组相关峰鉴别基团的存在是个较重要的原则。在一些情况下，因与其它峰重叠或峰强太弱，并非所有的峰都能观测到，但必须找出主要的相关峰才能认定基团的存在。

分析红外图谱是一件仔细的工作，首先必须熟悉各基团的特征吸收峰，了解它们可能在哪些区域出现，然后找出对应的相关峰佐证。

2. 特征区与指纹区

波数在 4000～1330cm^-1（波长为 2.5～7.5μm)区间习惯上被称为特征频率区，简称特征区。特征区吸收峰较疏，容易辨认。各种化合物中的官能团的特征频率都位于该区域，在此区域内振动频率较高，受分子其余部分影响小，因而有明显的特征性，它可作为官能团定性的主要依据。在这个区域中主要有ν_O-H、ν_N-H、ν_C=C-H、ν_C-H、ν_C=O、ν_C≡C、ν_C≡N、ν_C=C等一些基团的伸缩振动，还包括部分含单键基团的面内弯曲振动的基频峰。

波数在1330～667cm^-1（波长7.5～15μm)的区域称为指纹区。在此区域中各种官能团的特征频率具有鲜明的特征性。出现的峰主要是C—X(X=C、N、O)单键的伸缩振动及各种弯曲振动。由于这些单键的键强差别不大，原子质量又相近，所以峰带特别密集，犹如人的指纹，故称指纹区。分子结构上的微小变化，都会引起指纹区光谱的明显改变，因此在确定有机化物时用途很大。

（四)红外光谱解析

红外光谱可用来对化合物作定性鉴定、定量分析和结构分析。所有这些分析都离不开谱图的解析。所谓谱图解析就是根据红外光谱图上出现的吸收带的位置、强度和形状，利用各种基团特征吸收的知识，确定吸收带的归属，确定分子中所含的基团，结合其他分析所获得的信息，作定性鉴定和推测分子结构或立体结构。在进行化合物的鉴定及结构分析时，对图谱解析经常用到直接法、否定法和肯定法。

在用红外光谱对未知物进行解析之前，根据其它分析数据（如元素分析数据、熔点、沸点等)写出分子式，并根据分子式计算不饱和度。不饱和度计算的经验公式为：

  （12-15)

式中n₆、n₅、n₄、n₃、n₂、n₁分别代表六价、五价、四价、三价、一价原子的数目。双键（，)和饱和环状结构的不饱和度为1，三键（,)的不饱和度为2，苯环的不饱和度为4，二价原子如氧、硫等不参加计算。

不同化合物具有不同的红外光谱，各类化合物的主要官能团及其吸收峰位见表12-4。

表12-4 化合物的主要官能团及其吸收峰位

【例12-2】有一化合物分子式C₇H₆O，其IR光谱图见图12-25，试推测结构。

图12-24化合物C₇H₆O红外谱图

  解： ①计算不饱和度：

 ②3060、1600、1585、1500、1460cm^-1的吸收说明有苯环，结合在735、685cm^-1的两个吸收可以认为是单取代苯环。

③1700cm^-1的强吸收是ν_C＝O，波数较低，应该有共轭。

④ 2830、2700 cm^-1两个吸收是醛的特征吸收。

⑤两个基团：单取代苯环和—CHO结合的分子式与C₇H₆O相符，初步判断该化合物为苯甲醛Ph—CHO。

⑥与苯甲醛标准图谱对照，图谱一致，解析结果正确。

三、红外光谱仪

红外光谱仪由光学系统、电学系统、机械系统和计算机系统组成。图12-25给出了双光束红外光谱仪的概略系统图。

图12-25  双光束红外光谱仪系统图

自光源发出的连续红外光对称地分为两束，一束通过样品池，一束通过参比池。这两束光经过半圆形扇形镜面调制后进入单色器，再交替地射在检测器上。当样品有选择地吸收特定波长的红外光后，两束光强度就有差别，在检测器上产生与光强差成正比的交流信号电压。这信号经放大后带动参比光路中的减光器（光楔)使之向减小光强差方向移动，直至两光束强度相等。与此同时与光楔同步的记录笔，可描绘出物质的吸收情况，得到光谱图。

四、红外分光光度法的应用

（一)定性分析

已知物的定性，往往要用标准谱图作对照。红外光谱的谱图可由于谱图的表示方式、仪器的性能和操作条件的不同而有所差异。但是对于同一种物质而言，特征吸收频率的位置和相对强度的顺序是相同的。在实际工作中要注意这个问题。标准图谱分图谱集、穿孔卡片两种。

1. 萨特勒红外谱图集

这是一套收集谱图最多、比较实用的图集。它收集了棱镜、光栅光谱和傅里叶变换三代仪器的光谱图约10多万张。由美国萨特勒（Sadtler)实验室编制，于1947年开始出版。它分为化合物标准谱图和商品谱图两大部分。这套谱图有下列索引：化合物名称、分子式、官能团等索引，这些光谱图已经数字化，可用于计算机的检索。

2. Wyandotte—ASTM穿孔卡片

这是美国试验材料学会（ASTM)和万道特(Wyandotte)化学公司在1954年开始出版发行的穿孔卡片。目前已出版14万多张。必须用IBM统计分类机和电子计算机检索。

（二)定量分析

红外光谱的定量分析不仅可对单组分进行定量分析，还可对多组分样品进行定量分析。红外定量分析时样品不用分离，不受样品状态的限制，气、固、液体均可以进行分析。可以对异构体、过氧化物和高分子化合物等这些用气相色谱法难以测定的物质进行定量分析。但红外光谱定量分析灵敏度低、准确度较差，不适于进行微量分析。

（三)红外吸收光谱新技术—差示光谱

在光谱分析中，经常需要知道两种光谱之差。例如在溶液光谱中去掉溶剂的光谱，便可得到纯溶质的光谱；在二元混合物中，去掉一个组分的光谱，便可得到另外一个组分的光谱，该光谱称为差示光谱。

使用差谱技术，可以不经化学分离而直接鉴定出未知混合物的各组分，甚至是微量的组分。而这些微量组分的红外吸收峰往往被大组分的主体的红外吸收峰所掩盖，在一般IR吸收谱图上很难观察到。因此差谱技术在一定程度上解决理化分离所不能解决的问题，称之为“光谱分离”技术。

  (李珊，康维钧)

第七节  核磁共振波谱法

一、概述

在外磁场的作用下，某些有磁矩的原子核能产生核自旋能级分裂。当用一定频率的电磁波照射分子时，如果其能量大小恰等于某原子核相邻两个核自旋能级的能量差，则原子核将从低自旋能级跃迁至高自旋能级，这种现象称为核磁共振（nuclear magnetic resonance)。以核磁共振信号强度对照射频率（或磁场强度)作图，所得图谱称为核磁共振波谱(nuclear magneticresonance spectrum)。利用核磁共振波谱对物质进行定性、定量及结构分析的方法称为核磁共振波谱法。

二、核磁共振的基本原理

自旋量子数的原子核有自旋现象。其中的核，核电荷呈球形均匀分布于核表面，如¹H、¹³C、¹⁵N、¹⁹F、³¹P等，它们的核磁共振现象较为简单，是核磁共振研究的主要对象。目前研究和应用最多的是¹H和¹³C的核磁共振波谱。下面以¹H即质子为例介绍核磁共振的基本原理。

原子核由于自旋而具有磁性，质子自旋时产生一个微小磁场，就像一个小磁铁一样。在外加磁场的作用下，它将有两种排列方式：一种是其磁场方向与外加磁场方向相同，另一种是其磁场方向与外加磁场方向相反。这两种排列方式分别相应于它的低能级和高能级。当质子吸收能量后，就会从低能级跃迁到高能级，这种能量的吸收和其它吸收光谱一样也是量子化的。两个能级的能量差为

 （12-16)

式中，为磁感应强度，单位为T（特斯拉，Tesla)；r为磁旋比，单位为T^1·s^1，每种核都有其特定值，质子的r为2.68×10⁸ T^1·s^1；h为普朗克常数。

用电磁波照射处于外磁场中的质子，当电磁波的能量（E = hv₀)恰好等于两能级的能量差时，自旋核就会吸收能量从低能级跃迁至高能级，这种现象称为核磁共振。这时

  （12-17)

质子发生核磁共振吸收电磁波的频率，即共振频率为

  （12-18)

例如，在外磁场B₀ = 4.69 T的超导磁体中，质子的共振频率为

这个频率处于电磁波谱的无线电波区，即射频区。

由式12-3可知，要获得NMR谱，可有两种方式：一种是固定磁感应强度B₀，连续改变电磁波频率v₀进行扫描达到共振条件，称为扫频；另一种是固定电磁波频率v₀，连续改变磁感应强度B₀进行扫描达到共振条件，称为扫场。

三、核磁共振波谱仪

核磁共振波谱仪的种类和型号很多，但仪器的结构和组成基本相同，如图12-1所示，一般由强磁场、磁场扫描发生器、射频振荡器、探头、射频接受器和记录处理系统等组成。其工作原理如下

图 12-26核磁共振仪结构示意图

将装有试样的样品管插入处于两磁极的探头中央。样品溶液应为不粘滞液体，固体样品可用非质子溶剂（如CCl₄、CS₂)或氘代溶剂（如D₂O、CDCl₃)溶解配成溶液。测定时，利用高速气流使样品管均匀快速旋转，使样品感受的磁场均匀。绕在磁铁两极上的扫描线圈，在磁场扫描发生器的控制下，可在一定范围内连续改变磁场强度。射频振荡器产生一定频率的电磁波，以用来激发核。固定射频振荡器产生的电磁波频率，连续改变磁场强度进行扫描，当射频振荡器发射的电磁波频率v₀与磁感应强度B₀之间的关系符合式12-3时，被测物分子中的质子就吸收能量而发生核磁共振，产生的共振吸收信号和扫场的磁场强度通过射频接受器送到记录处理系统，即可获得核磁共振波谱图。

四、核磁共振波谱

图12-2为乙醇的核磁共振波谱图，从图上可以得到三方面的信息，即化学位移、积分线以及自旋耦合情况，这些信息对分子结构分析非常重要。

图12-27 乙醇的核磁共振波谱图

（a)低分辨 （b)高分辨

1. 化学位移

如果分子中所有质子的共振频率都相同，则根据式12-3，核磁共振谱图上就只有一个吸收峰，它对分子结构的分析毫无价值。但实际情况并非如此，从图12-2（a)可见，图谱上有三个吸收峰，即出现了三种不同质子的核磁共振信号。这是因为质子在分子中的位置及环境不同，其周围的电子云密度不同的缘故。当质子自旋时，其周围的电子云也随之转动，在外加磁场作用下发生环流，产生一个与外加磁场方向相反的小感应磁场，这时质子实际“感觉”到的磁场B比孤立质子（也称裸核)理论所需外加磁感应强度B₀稍有降低（百万分之几)，这种现象称为屏蔽效应。由于屏蔽效应的存在，核磁共振的条件应为

（12-19)

式中，s 称为屏蔽常数。

从式12-4可知，质子周围电子云密度越大，屏蔽作用越大，s 越大，质子对外界磁场的实际“感觉”越小，要使核外有电子云的核产生核磁共振，外磁场强度必须增大。

质子在分子中所处的化学环境不同，核外电子云密度不同，受到的屏蔽作用就不同。屏蔽作用强，则共振吸收峰将出现在高场，反之，则出现在低场。这种由于质子周围化学环境不同，其核磁共振频率发生位移的现象叫化学位移（chemical shift)。

因为化学位移的数值极其微小，很难测量其绝对值，并且化学位移的大小与仪器的磁场强度或电磁波频率有关，磁场强度或电磁波频率不同，同一化学环境质子的化学位移也不相同。为了便于比较，一般选用一种参考物质作标准，采用相对化学位移d（简称化学位移)来表示，其定义为

   （12-20)

或

  （12-21)

式中，、分别为标准物质的共振频率和共振磁感应强度；、分别为样品的共振频率和共振磁感应强度；B₀和v₀为仪器的磁感应强度和电磁波频率。

通常以四甲基硅烷（TMS)作为标准物质，并规定其d 值为0。

影响化学位移的因素主要有相邻基团的电负性、磁各向异性、杂化效应、氢键和溶剂效应等。

2. 积分线

图12-2（b)中从左到右呈阶梯形的曲线称为积分线。质子的核磁共振吸收信号的强度（吸收峰面积)与处于某一化学环境的质子数目有关，这是分析化合物分子结构的又一重要信息。吸收信号的强度用吸收峰面积的积分值表示，而积分线的高度则表示积分值的大小。

3. 自旋耦合

图12-2（b)是乙醇的高分辨核磁共振谱图，和图12-2（a)相比，可以看到（a)处甲基上质子的共振吸收峰分裂为三重峰，（b)处亚甲基上质子的共振吸收峰分裂为四重峰。这种峰的分裂是由于自旋的质子之间相互作用引起的。这种作用称为自旋-自旋耦合（spin-spin coupling)。由于自旋耦合使得相邻核所需的外磁场强度（或电磁波频率)发生更微小的改变，或加强或减弱，在高分辨的NMR谱中会引起共振吸收峰分裂，所以又叫自旋-自旋分裂（spin-spin splitting)。两个分裂峰之间的距离称为偶合常数（couplingconstant)，用J表示，见图12-3。J值的大小反映了相邻质子之间相互作用的大小。J值的大小与外磁场强度无关。

图12-28  质子自旋-自旋耦合示意图

五、核磁共振波谱的应用

核磁共振波谱法是研究分子结构的重要工具之一，在化学、生物、医药卫生和临床等领域应用广泛。

1. 在分子结构研究方面的应用

核磁共振波谱是研究分子结构的重要工具之一，可用来研究分子的立体结构（构型和构象)、互变异构、反应机理等。综合核磁共振波谱图中的各种信息，可以对物质的分子结构进行推断。从化学位移可以推断各种质子的化学环境，如邻近基团的电子效应及空间效应等。从峰的分裂情况和耦合常数可以推断邻近质子的数目和种类。从各组吸收峰的相对积分面积可推断各类质子的比例或个数。

2. 在定量分析方面的应用

核磁共振波谱中峰的积分线高度与相应的质子数成正比，不仅可用于分子结构分析，而且还可用于定量分析。核磁共振波谱定量的最大优点是不需要引进任何校正因子，且不需要化合物的纯样品就可直接测出其浓度。例如英国药典1988年版中规定庆大霉素用NMR法测定。更为重要的是，核磁共振在测定混合物中各组份的含量时更显出其优越性，尤其是一些平衡体系中各组分的定量，如酮式和烯醇式共存体系中各组分的定量。但由于仪器价格昂贵等缺点，该法不是常用的定量方法。

3. 在医药卫生方面的应用

由于核磁共振可深入物体内部，且具有不破坏样品的特点，因此在原位、在体、实时、无损、活体分析方面有广泛的应用前景。如活性酶的结构、病变组织与正常组织的鉴别、药物与受体之间的作用机制等，尤其是以¹HNMR基本原理为基础发展起来的磁共振成像（magneticresonance imaging，MRI)，在临床诊断中既能提供类似X射线断层扫描（CT)的纵向截面图，又不产生辐射损伤，已成为许多大医院的常规诊断设备。

除了¹H以外，自然界中还有100多种同位素的核具有磁矩，也可以用NMR方法进行研究。但迄今为止，只研究了其中少数几种核的共振行为。

（黄丽英  毋福海)