综合性实验四流行性感冒病毒血凝抑制试验
病毒性感染的正确诊断有助于临床确诊、合理治疗以及为控制流行制定有效的措施。诊断所
用方法包括病毒的分离鉴定、形态学检查、血清学试验和核酸检测。标本的采集原则和要求
是：(1
)早期采集；(2)由感染部位采集；(3)注意无菌操作，对易受污染的标本应使用抗生素；(4)
标本应低温保存并尽快送检；(5)血清学试验应采集患者急性期与恢复期双份血清。
病毒的分离培养是病毒生物学特性研究、疫苗制备、临床诊断和药物选择等方面非常重要的
技术方法。由于病毒为细胞内专性寄生，所以必须以活细胞为病毒的培养环境。根据不同病
毒的特性，培养方法可选择细胞培养法、鸡胚培养法和动物接种法。
细胞培养法是将离体分散的活细胞置于细胞培养瓶内，加入培养液，在适当温度、气体条件
下培养，细胞生长到一定程度时接种病毒，病毒增殖后可使细胞出现病变，以此来分离和鉴
定病毒。
鸡胚培养法是病毒培养的常用方法之一，在痘类病毒、粘液病毒和疱疹病毒的研究中占重要
地位，主要是因为鸡胚的组织分化程度低，鸡胚来源充足，操作简单，对接种的病毒不产生
抗体。
动物接种主要用于病毒的分离、鉴定、制造疫苗和免疫诊断血清等，途径有脑内接种、腹腔
内接种、皮下和皮内接种及鼻腔内接种。
病毒血清学试验是诊断病毒感染和研究病毒的重要手段。其基本原理和细菌血清
学反应相同，可用已知抗原检测病人的未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。由于病毒
隐性感染普遍存在，所以在检测病人抗体时，必须取患者急性期血清和恢复期血清(双份血
清)进行对比试验，若第二次血清抗体效价比第一次高出4倍以上时，才有诊断意义。常用的
血清学试验有：中和试验、补体结合试验、血凝和血凝抑制试验、免疫荧光技术、酶免疫组
化法、酶联免疫吸附试验、固相放射免疫测定等。
一流感病毒的鸡胚培养法
【实验目的】
熟悉鸡胚培养法及用途。
【实验原理】
鸡胚接种法为常用病毒培养法之一，操作简便，来源容易。鸡胚接种法分为(1)绒毛尿囊膜
接
种法，主要用于牛痘病毒、单纯疱疹病毒的培养；(2)羊膜腔接种法，主要用于从临床标本
分离病毒；(3)尿囊腔接种法，主要用于流感病毒、新城鸡瘟病毒、腮腺炎病毒的培养和传
代；(4)卵黄囊接种法，主要用于立克次体和鹦鹉热衣原体的分离与培养。
流感病毒的原代分离一般采用鸡胚的羊膜腔接种，而次代以后传代或制备流感疫苗时可采用
尿囊腔接种。
【实验内容与方法】
一观察鸡胚胎模型
【材料】
10日龄鸡胚
【方法】
取孵育10日龄鸡胚，照视观察是否存活：(1)血管是否清晰；(2)胚胎是否活动，观察小鸡的
眼睛黑点是否移动；(3)蛋的一边(较亮)和胎盘一边(暗红色)是否界限分明，如果胎盘一边
变黑或变苍白都表示已死去。标出气室及胚胎位置。注意绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵
黄囊的位置。
二尿囊腔接种法
【材料】
流感病毒(疫苗)液10日龄鸡胚注射器12号针头小钻眼科镊子碘酒和酒精棉球
无菌毛细管无菌试管
图11鸡胚尿囊腔接种法
【方法】
1避开鸡胚血管，在离气室边缘上0.5cm处作一标记，定为注射口。用碘酒和酒精在注射
口和气室处消毒，并在注射口钻一小孔。
2用无菌的注射器吸取0.1～0.2ml已稀释的流感病毒液，由小孔垂直插入，向鸡胚方向深
入1cm左右，不能伤及鸡胚，注入流感病毒液。
3石腊溶化封口，置37℃温箱中，每日翻动二次，照检一次。24
小
时内死亡者弃去。48～72小时后移入4℃冰箱6小时或过夜(如急需收获病毒液可放—20℃30
～60分
钟)，将鸡胚冻死使血液凝固，以免收获时血管破裂出血影响效价。注意鸡胚直立，令气室
向上。
4收获尿囊液之前，取出鸡胚用酒精消毒气室端，用镊子击破气室卵壳，沿气室边缘用镊
子撕去孵膜，在绒毛膜无大血管处穿破，用无菌毛细管吸取尿囊液，一般可得4～6ml。
二流感病毒血球凝集试验
【实验目的】
了解流感病毒血凝试验的原理、方法和结果分析。
【实验原理】
病毒能在尿囊的内胚层细胞繁殖，繁殖的病毒被释放到尿囊液中，因此尿囊液中含有大量的
病毒，可用血凝试验来测定病毒的存在。
流感病毒颗粒具有两种抗原，即可溶性抗原和血凝抗原。可溶性抗原是同一型中各亚型病毒
所共有的，而血凝抗原是各亚型所特有的。因此，利用可溶性抗原作补体结合试验可确定病
毒的型别，用血凝抑制试验可鉴定病毒的亚型。
血凝素(HA)是流感病毒表面的一种糖蛋白，能与人及一些哺乳动物的红细胞发生凝集反应，
这不属抗原—抗体的特异性凝集，而是由于病毒的HA与红细胞表面的糖蛋白受体结合所致。
血凝试验可用来测试病毒体的存在，也可用于病毒的鉴定。
【实验内容与方法】
一流感病毒血球凝集试验
【材料】
流感病毒鸡胚尿囊液抗流感病毒免疫血清0.5%鸡红血球悬液生理盐水小试管1毫
升吸管
【方法】
1.取小试管9支排于试管架上，按下表进行试验，每支各加入生理盐水0.5毫升。
2.第一管加入病毒(1∶5)0.5毫升即成1∶10，混匀后吸出0.5毫升放入第二管，如此依次稀
释至8管，自第8管吸出0.5毫升连同吸管一并放入消毒缸内。第九管不加病毒，为红细胞对
照管。
3.每管加入0.5%鸡红血球悬液0.5毫升，摇匀后放室温22～24℃45分钟(或冰箱0～4℃中2小
时)观察结果并记录。
病毒血凝试验试管号加样〖〗1
〖〗2〖〗
3〖〗4〖〗5〖〗6〖〗7〖〗8〖〗9
生理盐水(ml)〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5
病毒液(ml)〖〗0.5〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—〖〗—
病毒稀释度〖〗1∶10〖〗1∶20〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗
1∶1280〖〗—
鸡红细胞液(ml)〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5〖〗0.5
摇匀，置室温45分钟。
三流感病毒血凝抑制试验
【实验目的】
了解流感病毒血液疑抑制试验的原理方法的结果分析。
【实验原理】
流感病毒血凝素如果首先遇到相应的抗体
，则被抗体中和而失去凝集作用，据此原理建立的血凝抑制试验可用已知抗体鉴定未知病毒
，或用已知的病毒抗原来测定病人血清中的相应抗体。
【实验内容与方法】
1取小试管10支排于试管架上，于第一至第七管中各加入生理盐水0.25ml，第十管加
入生理盐水0.5ml。
2第一管加入血清(1∶5)0.25ml，混匀后吸出0.25ml放入第二管，如此依次稀释至第七
管
，自第七管吸出0.25ml连同吸管一并放入消毒缸内。第八管加1∶5血清0.25ml，为血清对照
管。第九管不加血清，为抗原对照管。第十管不加血清，为红细胞对照管。
3除第八和第十管外，其余各管加入0.25ml含4个单位的病毒抗原。抗原单位以血凝试验中
的凝集情况确定，如血凝试验的血凝效价为1∶320医学全.在线
，为1个血凝单位，0.25ml中含4个单位即1∶80。
4摇匀后，置室温10分钟，每管加入0.5%鸡经血球悬液0.25ml(从第一至七管，血清的最终
稀释度分别为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280)，摇匀后放室温
45分钟(或冰箱4℃2小时)，观察结果并记录。
【结果分析】
(一)血凝试验
切勿将试管振摇，应轻轻拿起观察管底。
先观察对照管。
根据不同的血清稀释浓度，各管中出现不同的红细胞凝集，具体记录如医学全.在线www.med126.com下：
-：无红细胞凝集，红细胞在管底形成一个小团，边缘光滑整齐。
+：红细胞在管底形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝集块。
：红细胞在管底形成一个环状小团，四周有小凝集块。
：红细胞呈薄层，均匀铺在管底，但边缘不整齐，有下沉趋向。
：红细胞呈较厚层，均匀铺在管底，无红细胞沉积。
血凝效价：以出现“++”凝集的最高病毒液稀释度作为血凝效价，即含一个
血凝单位，如第5管1∶160，则该病毒悬液含1个血凝单位。
(二)血凝抑制试验
先观察对照管。
如抗原对照管出现完全凝集，血清对照管和红细胞对照管不发生凝集，再观
察试验管，判断效价。一般以能完全抑制病毒抗原发生红细胞凝集的血清最高稀释度即为该
血清的血凝抑制效价。
比较早期、恢复期血清的血凝抑制抗体的效价，并作出判断。
【思考题】
①如血凝抑制试验抑制到第5管，则血凝抑制效价为多少?
②血凝抑制试验设立了哪些对照管?为什么要设立这些对照?
(龙北国张文炳罗军)
