课程名称

生物化学

年级

专业、层次

本科临床医学类

授课教师

职称

课型（大、小)

大

学时

4

授课题目（章、节)

第十章  DNA的生物合成

教材名称

《生物化学》第七版

作者

查锡良

出版社

人民卫生出版社

主要参考书

（注明页数)

赵宝昌 主编. 生物化学(第二版). 北京:高等教育出版社,2009年1月. 第十二章 DNA的生物合成.

目的与要求：

1. 掌握：分子生物学的中心法则及其扩充。DNA半保留复制的概念。DNA复制的特点。DNA复制的条件。复制保真性的酶学依据。原核生物DNA复制的基本过程。逆转录酶和逆转录的概念。基因突变的概念与意义。基因突变的类型。DNA损伤修复的机制。

2. 熟悉：DNA半保留复制的实验证据。复制中的解链和DNA分子拓扑学变化。真核生物DNA的生物合成过程。

3. 了解：逆转录合成的过程。滚环复制、D环复制过程。诱变因素及基因突变的后果。

教学内容与时间安排、教学方法：

1.教学内容与时间安排

分子生物学的中心法则及其扩充，DNA复制的特点 1.0学时

DNA复制的条件，复制保真性的酶学依据    1.0学时

原核生物和真核生物DNA复制的基本过程       1.0学时

逆转录，基因突变，DNA损伤修复的机制    1.0学时

2. 教学方法：

讲授+演示+启发+讨论。

教学重点及如何突出重点、难点及如何突破难点：

1. 重点：DNA复制的特点和条件。原核生物DNA复制的基本过程。基因突变的概念与类型。DNA损伤修复的机制。

2. 难点：DNA复制的酶学。DNA复制的基本过程。

3. 课件色彩及语言强调突出重点；采用图片及动画演示理解难点。

教研室审阅意见：

   同意。

  教研室主任签名：李洪

 2009 年2 月 28 日

基 本 内 容

课堂设计和时间安排

第三篇 基因信息的传递

☆DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。 DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

生物体内遗传信息的流向。

第十章 DNA的生物合成(复制)

☆第一节 复制的基本规律

一、半保留复制是DNA复制的基本特征

☆DNA半保留复制的概念。DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制。

DNA半保留复制示意图。

☆DNA半保留复制的实验证明：DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含¹⁵N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为¹⁵N。然后将大肠杆菌移至只含¹⁴N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。

DNA半保留复制研究实验结果示意图。

半保留复制的意义：按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制

DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin) 。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列。

☆习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段)定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。

☆DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

复制起始点与复制子示意图。

复制起始点、复制子与复制叉。

☆DNA复制时，以复制起始点(origin)为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制(bidirectional replication)。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制)。

DNA的双向复制示意图。

三、DNA子代链复制方向与解链方向相反导致不连续复制

参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3"端自由羟基（3"-OH)的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50~ 100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

DNA聚合酶只能以5"→3"方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是3"→5"。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。

DNA的半不连续复制。

☆领头链和随从链的概念。以3"→5"方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5"→3"，这一条链被称为领头链(leading strand)。以5"→3"方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5"→3"，这条链被称为随从链(lagging strand)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

☆冈崎片段的概念。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

★第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化

一、复制的基本化学反应是核苷酸之间脱水缩合生成磷酸二酯键

DNA复制时，在聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP，脱水缩合生成3",5"-磷酸二酯键而连接成多核苷酸链。

DNA复制过程中脱氧核糖核苷酸的聚合反应。

DNA的复制还是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

二、DNA聚合酶催化核苷酸之间的缩合反应

☆全称：依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )。简称：DNA-pol。活性：① 5"→3"的聚合酶活性；② 5"→3"或3"→5"核酸外切酶活性。

DNA聚合酶的核酸外切酶活性。

（一)原核生物DNA聚合酶

在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（pol Ⅰ)，DNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ)，DNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ)，这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol Ⅲ和pol Ⅰ。

☆pol Ⅰ为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段保留了两种酶活性,即5"→3"聚合酶和3"→5"外切酶活性，通常被称为Klenow fragment。

Klenow 片段的分子结构。

☆pol Ⅲ由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中α亚基具有5"→3"聚合DNA的酶活性，具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3"→5"外切酶的活性，与DNA复制的校正功能有关。

☆原核生物中的三种DNA聚合酶。

（二)真核生物DNA聚合酶

☆在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种：① DNA-pol α——起始引发，有引物酶活性。② DNA-pol β——参与低保真度的复制。③ DNA-pol γ——在线粒体DNA复制中起催化作用。④ DNA-pol δ——延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。⑤ DNA-pol ε——在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

☆真核生物的DNA聚合酶。

三、核酸外切酶的校读作用和碱基选择功能是DNA复制的保真性的酶学基础

☆为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：① 遵守严格的碱基配对规律；② DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；③ 对复制过程中出现的错误及时进行校正。

（一)核酸外切酶活性在复制中辨认并切除错配碱基。

（二)复制的保真性依赖于正确的碱基选择

DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键)与共价（磷酸二酯键)键的有序形成，即只有当碱基之间完成正确的氢键形成后，才会催化磷酸二酯键的连接。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

嘌呤化学结构的顺式和反式构型。

四、复制时双螺旋的解链伴有DNA分子拓扑学的变化

（一)解螺旋酶、引物酶和引发体

解螺旋酶(helicase) ，又称解链酶、DnaB蛋白或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。

引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP)，该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3"-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。

在E. coli中，含有解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome) 。DNA复制起始时的解链则是DnaA(辨认复制起始点)、DnaB和DnaC三种蛋白共同作用的结果。

引发体的组装形成。

引物酶催化合成短链RNA引物分子。

（二)单链DNA结合蛋白

单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein, SSB)，又称螺旋反稳蛋白(HDP)，是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。

☆SSB的生理作用：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

 （三)DNA拓扑异构酶

能够松解DNA超螺旋结构的酶。

人类拓扑异构酶Ⅰ的分子结构。

DNA复制过程中正超螺旋的形成。解链过程中正超螺旋的形成。

拓扑异构酶的作用特点：既能水解 、又能连接磷酸二酯键。

分类：拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ。

DNA拓扑异构酶的作用机制：拓扑异构酶Ⅰ——切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。 拓扑异构酶Ⅱ——切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。

双链DNA解开形成复制叉。

五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口

DNA连接酶(DNA ligase)执业药师可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。

DNA连接酶的连接作用。

☆DNA连接酶催化的条件是：① 需一段DNA片段具有3"-OH，而另一段DNA片段具有5"-Pi基；② 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③ 需要消耗能量，由ATP供能。

DNA连接酶的作用：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。

★第三节 DNA生物合成的过程

☆一、原核生物DNA的生物合成

（一)复制的起始：DNA解链形成引发体

原核生物DNA复制的起始阶段包括：

1. 解旋解链，形成复制叉：① 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA（需DnaA、B、C蛋白的协同作用)。② 单链DNA结合蛋白（SSB)四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。

2. 引发体组装和引物合成：① 由解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体；② 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3"端自由羟基（3"-OH)。

（二)复制的延长：领头链连续复制而随从链不连续复制

复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以3"→5"方向的亲代DNA链为模板，从5"→3"方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ。

DNA复制的延长过程。领头链的合成过程。随从链的合成过程。

DNA聚合酶Ⅲ催化领头链和随从链同时合成。

复制的延长过程。

（三)复制的终止：切除引物、填补空缺并连接断口

1. 去除引物，填补空缺：在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除；RNA引物水解后遗留的空缺，由DNA聚合酶Ⅰ催化延长空缺处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的断口。

2. 封闭断口，连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，生成断口最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

随从链上不连续性片段的连接。

复制的终止。

二、真核生物DNA的生物合成

（一)复制的起始：与原核生物类似

基本过程包括：解旋解链，形成复制叉；组装引发体，合成RNA-DNA引物。

☆主要区别：①复制起始点更多，序列更短；②复制有时序性，分组激活；③参与的酶和蛋白因子更多；④复制的起始与细胞周期的调控相关联。

☆真核生物DNA复制起始需要：① DNA聚合酶α —— 具有引物酶兼DNA聚合酶活性，催化RNA-DNA引物合成；② DNA聚合酶δ —— 具有解螺旋酶和DNA聚合酶活性，参与复制起始，并且是子代链延长时主要的复制酶；③ DNA拓扑异构酶和复制因子（RFA、RFC等)；④ 增殖细胞核抗原（PCNA)—— 可滑动的DNA链钳夹。

（二)复制的延长：三种DNA聚合酶的频繁转换催化领头链和随从链的合成

在真核生物DNA复制的延长阶段，在聚合酶α催化合成的RNA-DNA-OH 3"引物的基础上，由聚合酶ε取代聚合酶α催化领头链的连续合成，或由聚合酶δ取代聚合酶α催化随从链的不连续合成。 真核生物DNA复制的延长阶段。

由于真核生物DNA存在较多的复制子，故领头链和随从链都比较短。领头链通常为半个复制子的长度（双向复制)，而随从链则大致与一个核小体单位的长度相当。因此，延长阶段存在频繁的聚合酶之间的转换。 

（三)复制的终止：去除引物，连接冈崎片段，重建端粒

真核生物DNA复制终止时，由RNase H和内切核酸酶FEN1水解去除RNA-DNA引物，并由DNA聚合酶δ催化填补空缺，最后由DNA连接酶连接冈崎片段。同时，线状DNA复制完成后，3"-末端由于RNA引物被水解而形成空缺，需进行填补，即完成端粒的重建。

端粒（telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。

端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。

端粒的功能：维持染色体的稳定性；保证DNA复制的完整性。

线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase)的催化下，进行延长反应。

☆端粒酶(telomerase)：是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

端粒酶的组成：端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)；端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)；端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)。

端粒酶的作用机制——爬行模型。

第四节 逆转录和其他复制方式

一、逆转录病毒的基因组是RNA

逆转录病毒细胞内的逆转录现象。

二、逆转录的发现扩充了中心法则

☆逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，扩充了中心法则的内容。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

三、滚环复制和D 环复制

滚环复制(rolling circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。 滚环复制的过程。

D环复制(D-loop replication) ：是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。

第五节 DNA损伤(突变)和修复

☆DNA损伤的概念。由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation)。

常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

一、突变在生物界普遍存在的意义

（一)突变是进化、分化的分子基础

（二)突变导致基因型改变

（三)突变导致死亡

（四)突变是某些疾病的发病基础

二、多种内外因素可诱发突变

（一)自发因素

1. 自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。

2. 自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

3. 复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

（二)物理因素

由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

嘧啶二聚体的形成。

（三)化学因素

1. 脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。

2. 烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。

3. DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。

4. 碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。

5. 断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

常见的化学诱变剂。

☆三、突变的分子改变类型

点突变和复突变。

☆DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。

1. 转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

2. 颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

血红蛋白β-亚基的点突变。

3. 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。

4. 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。

缺失或插入都可导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失引起的框移突变。

5. 重排：DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

四、DNA损伤的修复有多种类型

☆DNA损伤修复(repair) ：是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。

修复的主要类型：光修复(light repair)、切除修复(excision repair)、重组修复(recombination repair)、SOS修复。

☆（一)直接修复系统（光修复)

这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。 修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成，该酶以FAD和MTHF（次甲基四氢叶酸)为辅助因子，在一定波长（300~600nm)可见光照射下被激活。

光修复酶的分子结构。

其修复过程为：①光修复酶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。②在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。③光修复酶从DNA上解离。

☆（二)核苷酸切除修复系统

这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。

在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNA pol Ⅰ和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC具有核酸内切酶活性，与受损片段的切除有关。

原核生物DNA切除修复的机制。

着色性干皮病（xeroderma pigmentosus，XP)是一种人类遗传性疾病，其发病机制与DNA修复系统缺陷相关。因此，人类DNA切除修复系统相关基因被命名为XP基因，包括XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG等。其中，XPF和XPG基因的表达产物具有核酸内切酶活性，XPF切割5"侧，XPG切割3"侧。

真核生物XP切除修复系统。

（三)重组修复系统

这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。

RecA重组蛋白修复DNA示意图。

（四)SOS修复系统

当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E. coli中，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛和长期的突变。

☆——重点

★——难点

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小  结

1. 遗传学的中心法则和反中心法则。

2. DNA复制的特点。

3. DNA复制的条件。

4. DNA复制的基本过程。

5. 逆转录的概念和意义。

6. DNA损伤及修复的分子机制。

复 习 思 考 题 、作 业 题

一、名词解释

 1. DNA半保留复制；2. DNA半不连续复制；3. 复制子；4. 复制叉；5. 领头链和随从链；6. 冈崎片段；7. 基因突变；8. 逆转录；9. 点突变。

二、问答题

1. 简述DNA复制的特点。

2. 简述DNA复制的条件。

3. 简述原核生物DNA复制的基本过程。

下 次 课 预 习 要 点

 第十一章 RNA的生物合成

1. 转录的概念。

2. 转录与复制的区别。

3. 转录的特点和条件。

实 施 情 况 及 分 析