实习六、食物及负荷尿中核黄素的测定

一、荧光法测定食物中的核黄素

 （一)目的意义

核黄素是机体的物质代谢和能量代谢中不可缺少的物质。通过测定食物中核黄素含量，可了解人体核黄素摄人情况。

  (二)原理

核黄素受到波长为440～500nm的光照射后能产生光黄素，此物质能产生较强的荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素浓度呈正比。

试液中再加入低亚硫酸钠(Na₂S₂0₄)，将核黄素还原为无荧光物质，然后再测定试液中残余荧光物质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。

（三)仪器和试剂 &nbwww.med126.com/wszg/sp;

 1．荧光光度计。图2核黄素吸附柱 Ib=内径宽度

2．高压消毒锅

3．锥形烧瓶、核黄素吸附柱（图2)。

4. 1.0 mol/L盐酸溶液  吸取分析纯浓盐酸83.3ml于1L容量瓶，加蒸馏水稀释至刻度。

5. 0.1mol/L盐酸溶液  吸上液100ml稀释至1L。

6. 4%氢氧化钠溶液，0.4%氢氧化钠溶液。

7. 3%高锰酸钾溶液。

8. 3%过氧化氢溶液。

9．核黄素储备液(25 μg/ml)  精确称取已干燥过的核黄素(在干燥器内放置24h) 25mg，加少量蒸馏水溶解后倒入1L容量瓶，加蒸馏水500ml，加入2.4ml冰醋酸，将其放在温水中摇动使颗粒完全溶解，冷却后稀释至刻度，加入少量甲苯，避光冷藏备用。

10．核黄素工作液(0.lyg/ml)  吸取上液10.Oml加水稀释至250ml。避光，贮于4℃冰箱中可保存1周。

11. 20%低亚硫酸钠溶液。用时现配，保存在冰水浴中，4h内有效。

12. 0.04%溴甲酚绿指示剂  称取O.lg溴甲酚绿于小研钵中，加1.4ml 0-4%

氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研磨直至完全溶解，加水稀释至250ml。

13.  2.5mol/L无水乙酸钠溶液，使用时配制。

14.  10%木瓜蛋白酶2.5mol/L乙酸钠溶液，使用时配制。

15.  10%淀粉酶2.5mol/L乙酸钠溶液，使用时配制。

16．洗脱液  丙酮：冰乙酸：水(5：2：9)。

    （四)操作步骤

整个操作过程需避光进行。

1．样品前处理  称取2～10g样品（约含10～200μg核黄素)于100ml锥形瓶中，加入50ml 0.1 mol/L盐酸，搅拌到样品颗粒分散均匀，置于高压锅内，在6.8kg（15磅)高压下水解样品30min。水解液冷却后，加入4%氢氧化钠调pH至4.5（取少许水解液用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿色pH为4.5)。

  2．酶解。

  (1)含有淀粉的水解酶加入3ml10%淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。

  (2)含高蛋白的水解液加3ml10%木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。

  上述酶解液用水定容后至100ml，过滤。滤液在4℃冰箱可保存1周。

  3．氧化去杂质  取试管2支分别编号为A和B，按表3顺序操作。

表3  氧化去杂质操作

混匀后放置2min以氧化样品中杂质与色素，再滴加3%过氧化氢至溶液褪色，以还原高锰酸钾。剧烈摇动试管，使多余氧气逸出。

4．核黄素的吸附和洗脱  吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，然后称取lg硅镁吸附剂用湿法装入柱子（约5cm高)。勿使柱内产生气泡，调节流速为60滴/分钟左右。将A管和B管内的氧化后液体通过吸附柱后，用约20ml热水洗脱样液中的杂质，再用5.Oml洗脱液将核黄素洗脱并收集于一带盖试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出的液体并定容至10ml，混匀后待测荧光强度。

5．测定荧光强度选择激发波长为420nm，发射波长为520nm，测量样品管及标准管的荧光强度。然后，在各管的剩余液中加0.1ml20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。

（五)计算

样品中核黄素量

式中A:样品管荧光值；

B:样品管空白荧光值；

C:标准管荧光值； ‘

D:标准管空白荧光值；

F:稀释倍数；

 W:样品重量g；

    S：标准管中核黄素含量μg。

  （六)．说明

  1．加入低压硫酸钠量不能过多以免影响荧光强度，加入后必须立即读数，否则核黄素又会被空气氧化为荧光型。

2．过氧化氢不宜多加，因会产生气泡而影响比色。

3．如加入高锰酸钾后有氧化锰细微褐色溶液混浊，可离心使之澄清。

4．不能用皂粉洗涤玻璃器材，应用硫酸-重铬酸钾洗液浸洗，再以清水洗净。