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临床检验基础实验指导-目录:实验八 嗜酸性粒细胞直接计数
来源:南华大学资源网 更新:2013/9/10 字体:

第一章血液检验的一般检验技术

实验一血液标本的采集

第二章  血液一般检验

实验一 红细胞计数

实验二 血红蛋白测定

实验三 网织红细胞计数

实验四 红细胞沉降率测定

实验五白细胞计数

实验六白细胞分类计数

实验七 白细胞形态检查

实验八 嗜酸性粒细胞直接计数

第三章 血栓与止血一般检验

实验一血小板计数

第四章 尿液检验

实验一 尿量测定

实验二 尿液酸碱度测定

实验三 尿蛋白定性检查

实验四 尿蛋白定量检查

葡萄糖定性检查"style="color:#FF0000" >实验五 尿葡萄糖定性检查

实验六 尿沉渣检查

第四章 脑脊液检验

实验一 脑脊液显微镜检查

实验二 脑脊液蛋白质定性检查

第六章 生殖系统分泌物检验

实验一 精子活动率和活动力检查

实验二 精子计数

实验三 精子形态检查

实验四 阴道分泌物检查

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

第一章血液检验的一般检验技术

实验一血液标本的采集

一、毛细血管采血法

[目的]掌握毛细胞血管采血法,了解不同部位采血对检验结果的影响。

[原理]采血针刺破毛细血管后血液自然流出,用微量吸管吸取一定量的血液。

[器材]一次性消毒采血针、20ul吸管、75%乙醇棉球、无菌干棉球。

[试剂]洗涤液3管、生理盐水。

[标本]外周血

[操作]

   1、准备  取试管1支,加入2ml生理盐水。取微量吸管和乳胶吸头相连,检查连接是否漏气,或取一次性微量吸管备用。

   2、按摩  轻轻按摩左手中指或无名指指尖内侧,使局部组织自然充血。

   3、消毒  用75%乙醇棉球擦拭采血部位皮肤,待干。

   4、针刺  用左手拇指和示指固定采血部位使其皮肤和皮下组织绷紧,左手持一次性消毒采血针自指尖腹内侧迅速刺入,深度2~3mm,立即出针。

   5、拭血  待血液自然流出后,用无菌干棉球擦去第1滴血。

   6、吸血  血液自然流出时,用一次性微量吸管吸血到10ul刻度,然后用无菌干棉球压住伤口止血。如血流不畅,可以用左手自采血部位远端向指尖稍施压使血液流出。

   7、稀释 用无菌干棉球擦净微量吸管外部后,将吸管伸入装有生理盐水的试管底部,慢慢排出吸管内的血液,并用上清液冲洗管内余血2~3次,最后将试管内的液体混匀。

[注意事项]

   1、所选择采血部位的皮肤应完整,无烧伤冻疮、发绀、水肿或炎症等。除特殊情况外,不要在耳垂采血。半岁以下婴幼儿由于手指小,可自拇指、脚趾或足跟内、外侧缘采血;严重烧伤者可选皮肤完整处采血。

2、本试验具有创伤性,必须严格控无菌技术操作,防止采血部位感染;做到一人一针一管,避免交叉感染,最好用一次性采血管。

3、皮肤消毒后,应待乙醇挥发后采血,否则流出的血液扩散而不成滴。

4、进出针速度要迅速,且伤口要有足够的深度。

5、因第1滴血混有组织液,应擦去。如血流不畅切勿用力挤压,以免造成组织液混入,影响结果的准确性。

第二章  血液一般检验

实验一 红细胞计数

[目的]掌握显微镜红细胞计数的方法。

[原理]用等渗稀释液将血液稀释一定倍数,充入计数池后,在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量,经换算求出每升血液中的红细胞数量。

[器材]显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒。

[试剂]红细胞稀释液

[标本]外周血或抗凝血(EDTA抗凝)。

[操作]

1、加稀释液  取小试管1支,加红细胞稀释液2ml。

2、加血  用清洁干燥微量吸管采集末稍血或抗凝血10ul擦去管外余血,轻轻加至红细胞稀释液底部,再轻吸上清液清洗吸管2~3次,立即混匀。

3、充池  混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池,室温下平放3~5min,待细胞下沉后于显微镜下计数。

4、计数  用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。

5、计算

25  N

红细胞/L=N×5×10×106×200=N×1010=100  ×1012

N:表示5个中方格内数得的红细数。

   25

× 5   :将五个中方格红细胞数换算成1个大方格红细胞数。

×10:将1个大方格红细胞数换1ul血液内红细胞数。

×106:1L=106ul

200:为血液的稀释倍数。

[注意事项]

1、采血时不能过分挤压采血部位,针刺激深度必须适当。

2、采血应顺利、准确,采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。红细胞数量明显增高时可适当加大稀释倍数。

3、大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则,避免多数或漏数。

4、将细胞悬液充入计数池时要一次完成,不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。

实验二 血红蛋白测定

[目的]掌握氰化高铁血红蛋白测定方法。

[原理]在血红蛋白转化液中,除硫化血红蛋白外,其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白,再与氰离子结合,生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰,可用校准的高精度分光光度计进行直接定量测定,或用HiCN参考液进行比色法测定,根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。

[器材]一次消毒采血针,微量吸管,试管,5ml移液管,75%乙醇棉球,无菌干棉球,分光光度计

[试剂]HiCN转化液(文齐液)

[标本]外周血

[操作]

1、直接定量测定

  (1)加转化液:试管内加5mlHiCN转化液。

  (2)采血与转化:取全血20ul,加到盛有转化液的试管底部,用上清液反复冲洗吸管3次,充分混合,静置5min。

  (3)测定:以符合WHO标准的分光光度计,波长540nm处,光径1.000cm,HiCN转化液或蒸馏水调零,测定吸光度。

  (4)计算:根据标本的吸光度直接计算出血红蛋白浓度(g/L)

   64458

  血红蛋白(g/L)=A×44000×251=A×367.7

A:540nm处测定管吸光度

64458:目前国际公认的血红蛋白平均相对分子质量。

44000:1965年国际血液学标准化委员会(ICSH)公认的血红蛋白摩尔消化系数。

251:稀释倍数。

   2、HiCN标准液比色法测定

  (1)标准曲线绘制和K值计算。用HiCN标准液倍比稀释后(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L),在所用的分光光度计上分别测事实上各稀释度的吸光度,以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制标准曲线索。或求出换算常数K。

  (2)标本的血红蛋白转化和比色同直接定量测定,得到标本的吸光度(A)

  (3)通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度,即Hb(g/L)=K×A。

[注意事项]

1、血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法,都必须以HiCN法为标准,绘制标准曲线。标准曲线或K值应定期检查,并与分光光度计相配。

2、标准微量吸管必须经过水银称重法校正。加液量必须准确,血液与转化液充分混匀。可用血红蛋白液代替抗凝血进行鉴定。

3、HiCN转化液不能贮存在塑料瓶中,否则会使CN丢失,测事实上结果偏低。HiCN转化液应贮存在棕色有塞玻璃瓶中,4℃冰箱保存一般可用数月,但不能在0℃以下保存,因为结冰可引起高铁氰化钾还原,使转化液褪色失效。

实验三 网织红细胞计数

[目的] 掌握网织红细胞手工计数的操作方法

[原理] 网织红细胞胞质内残存的少量核蛋白体和核糖核酸等嗜碱性物质,在活体染色时可被煌焦油蓝染成蓝色网状或颗粒状,可与完全成熟的红细胞区别。

[器材]显微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液、试管、玻片

[试剂]10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液

[标本]新鲜全血

[操作]

1、加染液  于小试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴,再加入新鲜全血2滴,立即混匀,置室温下15~20min。

2、制备涂片  取1小滴制成薄血涂片,自然干燥。

3、观察  在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

4、计数  在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。

5、计算

  计数的网织红细胞数

    网织红细胞分数数=  1000

网织红细胞绝对值(网织红细胞/L)=红细胞/L×网织红细胞分数数

实验四 红细胞沉降率测定

[目的]掌握魏氏法红细胞沉降率测定的原理及操作方法。

[原理]将一定量的枸橼酸钠抗凝全血置于特制血沉管中,直立于特制血沉架上1h后读取红细胞下沉后血浆的高度。

[器材]Westergren血沉管、血沉架、吸管、试管。

[试剂]109mmol/L枸橼酸钠溶液

[标本]新鲜全血

[操作]

   1、加抗凝剂  吸取浓度为109mmol/L的枸橼酸钠0.4ml于试管中。

   2、采静脉血  取静脉血1.6ml,加入含抗凝剂的试管中,混匀。

   3、装血沉管  用血沉管吸入混匀全血至刻度“0”处,拭去管外残留余血。

   4、立血沉管  将血沉管直立于血沉架上。

[注意事项]

   1、使用分析纯枸橼酸钠抗凝剂,配制时浓度应准确,配成后液体不浑浊、无沉淀,保存期为2周。

   2、严格控制采血量,使抗凝剂与血液比例为1︰4。

   3、血沉管内径要标准,放置要垂直,不得倾斜。

实验五白细胞计数

[目的]掌握显微镜法白细胞计数的原理及方法。

[原理]用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数,同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板,在显微镜下计数一定体积内的白细胞数,经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。

[器材]显微镜、改良Neubauer计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。

[试剂]白细胞稀释液

[标本]新鲜全血或末稍血

[操作]

1、加稀释液  用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。

2、吸取血液  用微量吸管吸取新鲜全血或末稍血20ul, 擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部,轻轻放出血液,并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管2~3次。

3、混匀  将试管中血液与稀释液混匀,待细胞悬液完全变为棕褐色。

4、充池  再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴,充入改良Neubauer计数板的计数池中,室温静置2~3min,待白细胞完全下沉。

5、计数  在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。

6、计算

  4个大方格内白细胞数(N) N

 白细胞= 4  ×10×20×106=20×109/L

[注意事项]

1、稀释用吸管、微量吸血管、血红细胞计数板均为计量工具,使用前需经执业药师过严格的校正,否则将直接影响计数结果的准确。

2、使用标本可为由静脉搏穿刺采取的新鲜全血,也可为静脉末梢血。采集末梢血时,应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等,以免标本失去代表性;同时也应注意不能过度挤压,以免组织液混入引起血液凝因或造成计数结果不准确。

3、在充池时,如充液不足、液体外溢、断续充液,或产生气泡、充液后移动盖玻片等,均会使细胞分布不均匀,造成计数结果不准确。

4、计数池内的细胞分布应均匀,一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%,若相差太大,应重新充池。

5、计数大小方格内的压线细胞时,遵循数上不数下、数左不数右的原则。

6、白细胞数量过多时,可采用加大稀释倍数的方法。

实验六白细胞分类计数

[目的]掌握显微镜外周血白细胞分类计数的方法及各种白细胞的正常形态。

[原理]将血液制成细胞分布均匀的血涂片,用瑞氏染液染色,根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进行分类并计数。通常分类100个白细胞,计算得出各种白细胞所占的百分率。

[器材]显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。

[试剂]瑞氏染液、磷酸盐缓冲液

[标本]制备良好的血涂片

[操作]

1、染色 将血涂片用瑞氏染液染色,冲洗干净,自然干燥后待用。

2、低倍镜观察  低倍镜下观察白细胞分布和染色情况。

3、油镜观察  选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域,按一定的方向顺序对所见的每1个白细胞进行分类,并用白细胞分类计数器作好记录,共计数100个白细胞。

4、计算  求出各类细胞所占的百分率

[注意事项]

1、由于各种白细胞体积大小不等,体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多,而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多,因此分类最佳区域为体、尾交界处。

2、分类时要有秩序地、没一定方向连续地进行,既不重复亦不遗漏,避免主观选择视野。

3、分类计数结果的记录也可采用手工画“正”或“++++”的方法。

实验七 白细胞形态检查

[目的]掌握各种白细胞病理形态学改变。

[原理]用普通光学显微镜,直镜观察经瑞氏染色后血涂片上的白细胞。从细胞大小、细胞核、细胞质等多方面观察细胞形态。

[器材]显微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液。

[试剂]瑞氏染液、磷酸盐缓冲液

[标本]制备良好的血涂片

[操作]

1、染色  将血涂片用瑞氏染液染色,冲洗干净,自然干燥后待用。

2、低倍镜观察  低倍镜观察细胞分布、数量、染色情况。

3、油镜观察  滴加香柏油1滴,在油镜下对白细胞从细胞大小、细胞核、细胞质等多方面做认真仔细地观察。

4、计算毒性指数  观察100或200个中性粒细胞,记录有病理变化的中性粒细胞数量,计数毒性指数。

   有中毒颗粒的中性粒细胞数

 毒性指数=  计数的中性粒细胞数

[注意事项]

1、含中毒颗粒的中性粒细胞应与嗜碱性粒细胞相区别,其区别要点是嗜碱性粒细胞核较少分叶,染色较浅,嗜碱性颗粒着色更深,较大且不均匀,细胞边缘常分布较多,也可覆盖分布于细胞核上。

2、在血涂片染色偏碱或染色时间过长时,可将中性颗粒误认为中毒颗粒。应注意全片各种细胞的染色情况。

实验八 嗜酸性粒细胞直接计数

[目的]掌握嗜酸性粒细胞直接计数的方法。

[原理]用嗜酸性粒细胞稀释液将血液稀释一定倍数,使大部分的红细胞和其他白细胞被破坏并使嗜酸性粒细胞着色。将稀释的细胞悬液滴入血细胞计数板,计数一www.med126.com/zhicheng/定体积内的嗜酸性粒细胞数量,经过换算得出每升血液中的嗜酸性粒细胞数量。

[器材]显微镜、改良Neubauber计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。

[试剂]

1、伊红丙酮稀释液。

2、Hinkelman稀释液。

3、乙醇-伊红稀释液。

4、皂素-甘油稀释液。

5、溴甲酚紫稀释液。

6、固绿稀释液。

[标本]新鲜全血或末梢血

[操作]

1、加稀释液  吸取嗜酸性粒细胞稀释液0.38ml于小试管中。

2、采血  用微量吸管采血20ul,擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管稀释液的底部,轻轻放出血认,并吸取上层稀释液清洗吸管2~3次。

3、混匀  将试管中的血液与稀释液混匀,待细胞完全溶解。

4、充池  再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴,充入改良Neubauer计数板的2个计数池中,室温下静置3~5min。

5、计数  低倍镜下计数2个计数池共10个大方格内的嗜酸性粒细胞数量。

6、计算

  10个大方格内的嗜酸性粒细胞

嗜酸性粒细胞/L= 10×10×20×106

[注意事项]

1、凡能引起白细胞计数误差的因素,嗜酸性业细胞计数时均匀应注意。

2、计数应在60min内完成,因时间太长,嗜酸性粒细胞会被逐渐溶解,造成结果偏低。

3、血液加入稀释液后应立即混匀,否则易致血液凝固和细胞聚集。因嗜酸性粒细胞易于破碎,振荡不宜太猛烈。若使用含甘油的稀释液,因甘油造成液体粘稠度增加,可增加振荡次数、延长振荡混匀时间。

第三章 血栓与止血一般检验

实验一血小板计数

[目的]掌握血小板的显微镜目视计数方法。

[原理]血液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后,充入血细胞计数板内在显微镜下计数一定范围内的血小板数量,经过换算求出每升血液中血小板的数量。

[器材]显微镜,血细胞计数板,采血针,血红蛋白吸管,试管。

[试剂]10g/L草酸铵稀释液。

[标本]外周血

[操作]

1、吸取稀释液 准确吸取10g/L  草酸铵稀释液0.38ml,置于清洁小试管中。

2、采血  常规消毒无名指,穿刺后,让血液自然流出,准确采血20ul,置于含有草酸铵的稀释液中,立即充分混匀。

3、稀释静置  待完全溶血后再混匀1min,置室温10min。

4、充液静置 取混匀的血小板悬液1滴充入血细胞计数板内,静置10~15min,使血小板充分下沉。空气干燥的季节应将血细胞计数板置湿盒内。

5、计数  用高倍镜计数血细胞计数板中央大方格内的四角和中央共5个中方格内血小板数量。

6、计算  每升血小板数=5个中方格内血小板数×109/L

[注意事项]

1、草酸铵稀释液要清洁,无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。

2、毛细血管采血时,针刺应达3mm深,使血液流畅。拭去第1滴血后立即采血,以防血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时,应先采血做血小板计数。

3、血液加入血小板稀释液内要充分混匀,但不可过度振荡,以免导致血小板破坏和聚集。

4、血小板悬液充入血细胞计数板内需要静置10~15min,使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度,避免水分蒸发而影响计数结果。

5、计数时光线不可太强,注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别,附着在血红细胞旁的血小板也要注意,不要漏数。

6、应在1h内计数完毕,否则结果偏低。

7、所用计量器材必须标准化。

8、检查前,患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。

 

第四章 尿液检验

实验一 尿量测定

[目的]掌握尿量的测定方法及注意事项。

[原理]采用有刻度的容器测定24h尿量。

[器材]量杯或量筒、洁净容器。

[标本]24h尿液。

[操作]清晨将尿液排空后弃去,用洁净容器留取随后的24h尿液,混合后准确测定尿量。

[注意事项]每次留取标本必须排空膀胱,尿量测定精确至毫升。气温过高时注意防腐。

[参考值]①成年人:1000~2000ml/24h。②1~6岁:300~1000ml/24h。③7~12岁:500~1500ml/24h。

实验二 尿液酸碱度测定

[目的]了解常用干化学试带测定尿液酸碱度的方法、原理及注意事项。

[原理]干化学试带的测试模块区含有甲基红和溴麝香草酚蓝,两种酸碱指示剂适量配合可测试尿液酸碱度。

[器材]洁净试管或尿标。

[试剂]尿多联化试带与标准色板。

[标本]新鲜尿液。

[操作]将试带用尿液浸湿后与标准色板比色,1min内读取pH。

[注意事项]

1、试带应在干燥、避光处保存,注意保质期,定期内标准质控液进行检测。

2、按说明书操作,1min内读取结果。

3、标准应新鲜,否则细菌繁殖会使pH增高。或因丧失挥发性酸而影响结果的准确性。

4、尿液pH还可作为其他检查项目的质控指标,若pH<3或pH>9均会影响其他检测结果。

实验三 尿蛋白定性检查

[目的]掌握尿蛋白定性的磺基水杨酸法。

[原理]磺基水杨酸是一种生物碱,在酸性条件下,磺基水杨酸的磺酸根离子与蛋白质氨基酸阳离子结合,形成不溶性的蛋白盐沉淀,沉淀生成的程度可反映蛋白质含量。

[器材]小试管、滴管、吸管、黑色衬纸及pH广泛试纸。

[试剂]200g/L磺基水杨酸溶液。

[标本]新鲜尿液或人工蛋白尿标本。

[操作]

1、加尿液  取小试管2支,各加清晰尿液1ml。

2、加试剂  于第1支试管内滴加磺基水杨酸溶液2滴,轻轻混匀;另1支试管不加试剂作空白对照,1min内观察结果。

3、判断结果  按表判断阳性程度及蛋白质的含量

   结果  报告方式 相当蛋白质含量(g/L)

清晰透明 — <0.05

在黑色背景上可见轻度浑浊 极微量 0.05~0.1

不需黑色背景即见轻度浑浊± 0.1~0.5

白色浑浊,但无颗粒出现  +  0.5~1.0

浑浊并出现颗粒 ++ 1.0~2.0

明显浑浊呈现絮状 +++ 2.0~5.0

浑浊,有大凝块++++ >5.0

[注意事项]

1、该法灵敏,极轻微反应无意义。判断结果应及时,否则会使阳性增高。

2、尿内含尿酸或尿酸盐过多。可出现假阳性,但反应较为缓慢,15s后出现浑浊,由弱渐强;或于加试剂1min后渐呈蛛丝状浑浊,缓慢扩散,覆盖于尿液的表面,加热或加碱可消失。

3、含碘造影剂、大剂量青霉素等也可使反应呈假阳性,但其反应与蛋白尿不同。应仔细观察并结合用药情况综合分析。

实验四 尿蛋白定量检查

[目的]了解尿液蛋白质定量双缩脲法的反应原理、检测方法。

[原理]钨酸可沉淀尿中的蛋白质,后者复溶于双缩脲试剂中,其碱性的Cu2+与蛋白质的肽键形成紫色复合物,呈色深浅与尿蛋白质含量成正比。

[器材]试管、滴管、分光光度计、离心机等

[试剂]

1、200g/L磺基水杨酸溶液。

2、15g/L钨酸钠溶液。

3、0.075mol/L硫酸。

4、双缩脲试剂。

5、蛋白标准液。

6、生理盐水。

[标本]新鲜尿液

[操作] 

1、测定尿量  准确测定患者24h尿量,反复混匀后取10ml离心沉淀留取上清液备用。

2、尿蛋白定性  采用磺基水杨酸法定性尿蛋白,阳性标本进行下列测定。

3、加标本处理

①加尿液:根据蛋白质半定量的结果决定标本的加入量。尿蛋白定性(+)~(++),于10ml离心管中加尿液5ml,如定性(++)~(+++),则取1ml尿液加4ml蒸馏水稀释。

②加沉淀剂:向离心管加入0.075mol/L硫酸2.5ml,混匀后再加15g/L钨酸钠溶液2.5ml,充分混匀后静置10min。

③离心:1500r/min离心5min后,倾尽上清液,将离心管倒置于干燥滤纸上吸干水分,保留沉淀待测。

④复溶:向沉淀中加生理盐水至1ml刻度,振摇以使蛋白质溶解,作为测定管。

4、双缩脲反应   按表测定,混匀后37℃水浴30min

尿蛋白定量双缩脲法

试剂  测定管标准管 空白管

生理盐水  1.0 __

2.5g/L蛋白标准液  _ 1.0_

双缩脲试剂4.0 4.0  4.0

5、比色和计算   波长540nm,空白管调零分别读取AA

 A     24h尿量(ml)

24尿蛋白总量(g)= A×2.5×   1000(ml) 

[注意事项] 24h尿标本最好不加防腐剂,冷藏保存,测定前充分混匀。

实验五 尿葡萄糖定性检查

[目的]掌握尿葡萄糖定性的班氏法。

[原理]葡萄糖或其他还原性糖的醛基在热碱性溶液中,能将班氏试剂的蓝色硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜,进而形成红色氧化亚铜沉淀。

[器材]试管架、中试管、滴管、试管夹、酒精灯。

[试剂]

1、甲液 枸橼酸钠,无水碳酸钠,蒸馏水加热助溶。

2、乙液  硫酸铜,蒸馏水加热助溶。冷却后,将乙液缓慢加入甲液中,不断混匀,冷却至室温后补充蒸馏水至1000ml。如溶液不透明则需要过滤,煮沸后出现沉淀或变色则不能应用。

[标本]新鲜尿液

[操作]

1、鉴定班氏试剂质量  取中号试管1支,加入班氏试剂2.0ml,摇动试管徐徐加热至沸腾,观察试剂有无颜色及性状变化,若试剂仍为透明蓝色,可进行以下实验。

2、加尿液  向班氏试剂中加离心后的尿液0.2ml,混匀。

3、加热煮沸  继续煮沸1~2min,或置沸水浴5min,自然冷却。

4、判断结果  判断结果见表

糖定性试验结果判断

反应现象 报告方式  葡萄糖含量(mmol/L)

蓝色不变 —  <5.6

蓝色中略带绿色,但无沉淀  ± 5.6~11.2

绿色,伴少许黄绿色沉淀 +<28

较多黄绿色沉淀,以黄为 ++ 28~56

土黄色浑浊,有大量沉淀+++ 57~112

大量棕红色或砖红色沉淀 ++++ >112

[注意事项]

1、试剂与尿液的比例为10︰1。

2、煮混时应不时摇动试管以防爆沸喷出,出可在沸水浴中实验。

3、检验糖尿病患者尿液中葡萄糖,应空腹或餐后2h留取尿标本。

4、尿液中有大量尿酸盐存在时,煮沸后也呈浑浊并带绿色,但久置后并不变黄色而呈灰蓝色,故必须于冷却后观察结果。尿中含大量铵盐时可抑制氧化亚铜沉淀的生成,应加碱煮沸除去。蛋白含量较高时也影响铜盐的沉淀,可用加热乙酸法除去。

5、一些非糖还原性物质,如水合氯醛氨基比林、PAS、阿匹林、青霉素、链霉素、VitC、异烟肼等,当基在尿中含量过高时亦呈阳性反应,应停药3d后再进行检查。对静脉输注大剂量VitC者5d内不宜做尿糖定性,或定性时先将尿液煮沸使之分解破坏。

实验六 尿沉渣检查

[目的]掌握尿沉渣非染色法显微镜检查的内容和方法。

[原理]采用显微镜观察的方法,根据尿液细胞、管型等有形成分的形态特征,识别并记录其在显微镜一定视野内的数量。

[器材]载玻片、离心机、刻度离心管、盖玻片、滴管、普通显微镜、定量尿沉渣分析板。

[标本]新鲜尿液

[操作]

1、未离心直接涂片法

(1)混匀:充分混匀尿液。

(2)制备涂片:取混匀的尿液1滴于载玻上,加盖玻片,注意避免产生气泡。

(3)观察计数:①先用低倍观察全片细胞、管型等成分的分布情况,然后用高倍镜确认。注意使用暗视野观察尿液有形成分,特别是透明管型。②管型在低倍镜下观察,至少计数20个视野;细胞在高倍镜下观察至少计数10个视野,取其平均值报告;结晶按高倍镜视野中分布范围报告。计数时要注意细胞的完整性,还要注意有无其他异常巨大细胞、寄生虫虫卵、滴虫、细菌、粘液丝等,男性尿液标本还要注意有无精子及卵磷脂小体。

2、离心沉淀涂片法

(1)离心尿液:透用于尿外观非明显浑浊的尿标本,是尿沉渣检查标准化推行的方法。取尿液10ml离心5min,要求相对离心力为400g。

(2)提取尿沉渣:手持离心管倾斜45°~90°,用滴管吸去上层尿液,保留下层0.2ml尿沉渣。

(3)涂片:轻轻混匀尿沉渣后,取1滴置载玻片上,用18mm×18mm或22mm×22mm的盖玻片覆盖后显微镜检查。

(4)观察计数:与未离心尿直接涂片法相同。

3、定量尿沉渣分析法  定量尿沉渣分析板由1块硬质塑料板制成,每块板内分为10个统一深度的计数池,每1个计数池内的计数区为1.0ul计数区分为10个大方格,每个大方格又分为9个小方格。

(1)未离心法:直接取充分混匀的尿液1滴充入定量尿沉渣分析计数池内,在低倍镜下计数10个大方格内管型总数,在高倍镜下计数10个大方格内细胞总数,此即每微升尿液某种细胞或管型的数量。

(2)离心法:尿液标本处理同离心尿沉淀涂片法,然后充池计数,方法同上。

4、报告结果

(1)涂片法:细胞以最低数~最高数/HP、管型以最低数~最高数/低倍镜视野报告。结晶以所占视野面报告,无结晶为(—);结晶占1/4视野(+);结晶占1/2视野为(++);结晶占3/4视野为(+++);结晶满视野为(++++)。如果细胞、管理的数量过多难以计算,也可按结晶的报告方式报告结果。

(2)定量尿沉渣分析板法:以每微升某种细胞或管型数报告。

第四章 脑脊液检验

实验一 脑脊液显微镜检查

[目的]掌握脑脊液显微镜检查的内容、方法。

[器材]显微镜、改良牛鲍计数板、微量吸管、刻度吸管、小试管。

[试剂]生理盐水或红细胞稀释液,冰乙酸,白细胞稀释液,瑞氏染液或瑞-吉染液。

[标本]新鲜脑脊液。

[操作]

(1)充池:直接用微量吸管吸取混匀的脑脊液,充入血细胞计数板的上下2个计数池。

(2)计数:静置2~3min后,低倍镜下计数2个计数池内四角和中央大方格共10个大方格内的细胞数。

(3)计算:10个大方格内的细胞总数即为每微升脑脊液细胞总数,再换算成每升脑脊液细胞总数。

[注意事项]

1、直接白细胞计数时,也可用微量吸管吸取冰乙酸后尽可能全部吹出,仅使吸管内壁粘附少许冰乙酸,再吸以少量混匀的脑脊液于吸管中,数分钟后吸管内红细胞溶解,然后再充池计数。

2、细胞计数时,如发现较多细胞有皱缩或肿胀等异常现象,应如实报告,以协助临床医学鉴别是陈旧性出血或新鲜出血。

3、血性脑脊液中的白细胞必须校正后才有价值,校正方法是分别计数血液红细胞、白细胞数和脑脊液细胞总数、白细胞数,扣除因出血而带进脑脊液的白细胞数。

   脑脊液红细胞数×血液白细胞数

白细胞校正数脑脊液白细胞未校正数—  血液内红细胞数

4、细胞涂片时,为了使细胞容易粘在玻片上,可取沉淀的细胞悬液2滴,加血清1滴,混匀后涂片。

5、涂片染色分类时,如见内皮细胞或异常细胞,则另行描述报告,必要时用巴氏或HE染色查找肿瘤细胞。

6、实验结果后,血细胞计数板用0.75%乙醇浸泡消毒60min,忌用酚浸泡,以免损坏计数板。

实验二 脑脊液蛋白质定性检查

[目的]掌握脑脊液蛋白质定性试验的方法。

[原理]脑脊液中球蛋白与苯酚结合,形成不溶性蛋白盐而产生白色浑浊或沉淀。

[器材]小试管、刻度吸管、尖滴管。

[试剂]饱和苯酚溶解。

[标本]新鲜脑脊液。

[操作]

1、加试剂  取试剂2ml于小试管中。

2、加标本  用尖滴管垂直滴加脑脊液标本1~2滴。

3、观察结果  在黑暗背景下立即用肉眼观察结果。

4、判断结果

(1)清晰透明,不呈现云雾状为(—)。

(2)呈微白雾状,对光不易看见,黑色背景下才能见到(±)。

(3)灰白色云雾状为(+)。

(4)白色浑浊或白色薄云状沉淀为(++)。

(5)白色絮状沉淀或白色浓云块状为(+++)。

(6)立即形成白色凝块为(++++)。

[注意事项]

1、当室温在10℃以下时,应将试剂保存在37℃温箱中,否则饱和度降低,可致假阳性。

2、试管内径以小为佳,一般为(13±1)mm,加入试剂后立即观察结果。

3、标本中如红细胞过多,应离心沉淀取上清液检测。

第五章 浆膜腔积液检验

实验一 浆膜腔积液显微镜检查

[目的]掌握浆膜腔积液显微镜检查的内容、方法。

[器材]显微镜、改良牛鲍计数板、微量吸管、小试管。

[试剂]生理盐水或红细胞稀释液,冰乙酸,白细胞稀释液,瑞氏染液或瑞-吉染液。

[标本]浆膜腔穿刺液。

[操作]

(一)有核细胞计数

1、直接计数法

(1)去除红细胞:在小试管内放入冰乙酸1~2滴,转动试管,使内壁粘附少许冰乙酸后倾去,滴加混匀浆膜腔积液3~4滴,混匀,放置数分钟,破坏红细胞。

(2)充池:用微量吸管取混匀破坏红细胞后的浆膜腔积液充入血细胞计数板的2个计数池内。

(3)计数:静置2~3min后,低倍镜计数2个计数池内四周和中央大方格共10个大方格内的有核细胞数。

(4)计算:10个大方格有核细胞总数即每微升浆膜腔积液的有核细胞总数,再换算成每升浆膜腔积液的有核细胞数。

2、稀释计数法

(1)稀释破坏红细胞:根据标本内有核细胞多少,用白细胞稀释液对标本进行一定倍数稀释,混匀,放置数分钟,破坏红细胞。

(2)充池:用微量吸管取混匀稀释后的浆膜腔液充入1个计数池。

(3)计数:静置2~3min后,低倍镜计数1个计数池内的四角和中央大方格共5个大方格内的有核细胞总数。

(4)计算:根据5个大方格内的有核细胞总数稀释倍数,计算每升浆膜腔积液的有核细胞数。

(二)有核细胞分类

1、直接分类法 有核细胞计数后,将低倍镜转为高倍镜,直接在高倍镜下根据细胞形态和细胞核形态进行分类,共分类计数100个有核细胞,分别计数单个核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及间皮细胞)和多个核细胞(粒细胞)的百分率。

2、涂片染色分类法  在抽出穿刺液后,立即以1000r/min离心5min,取沉淀物制成均匀的薄片,置于室温下或37℃恒温箱内尽快干燥,瑞氏或瑞-吉染色后油镜分类计数100个有核细胞。一般标本中可见到淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、间皮细胞等。

[注意事项]

1、有核细胞计数应包括间皮细胞。

2、必要时可采用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞,以提高白细胞分类计数的准确性。

3、有核细胞分类计数误差大,尤其是陈旧性、细胞变形的标本,故推荐采用涂片染色分类计数。

4、染色分类计数过程中,若发现间皮细胞和不能分类的异常细胞应中外描述或作HE、巴氏染色查找肿瘤细胞。

实验二 浆膜腔积液粘蛋白定性试验

[目的]掌握浆膜腔液粘蛋白定性(李凡他试验)的方法。

[原理]浆膜腔上皮细胞在炎症刺激下分泌粘蛋白。粘蛋白是一种酸性糖蛋白,其等电点pH为3~5,因此,可在稀乙酸中出现白色沉淀。

[器材]100ml量筒,滴管。

[试剂]冰乙酸、蒸馏水。

[标本]浆膜腔穿刺液

[操作]

1、加试剂  加2~3滴冰乙酸于100ml量筒中,再加大约100ml蒸馏水,混匀,此时溶液的pH为3~5,静置数分钟。

2、加标本  垂直滴加待测标本1滴于量筒中。

3、观察结果  立即在黑色背景下观察有无白色云雾状沉淀生成及其下降程度。

4、判断结果

(1)阴性、阳性结果的判断。

1)阴性:清晰,不显雾状或有轻微白色雾状浑浊,但在下降过程中消失。

2)阳性:出现白色雾状浑浊并逐渐下沉至量筒底部不消失。

(2)阳性程度的判断

1)渐呈白雾状为(±)

2)可见灰白色雾状为(+)

3)白色薄云状为(++)

4)白色浓云状(++++)

[注意事项]

1、血性浆膜腔积液经离心沉淀后,用上清液进行检查。

2、量筒的高度与蒸馏水的量要足够。

3、加入标本后立即在黑色背景下仔细观察结果。如浑浊不明显,下沉缓慢,中途消失者为阴性。

第六章 生殖系统分泌物检验

实验一 精子活动率和活动力检查

[目的]掌握精子活动率和活动力的检查方法。

[原理]精液液化后,将精液滴于载玻片上,显微镜下观察精子的活动情况,计算活动率和活动力。

[器材]显微镜,载玻片,盖玻片。

[试剂]5g/L伊红Y染液

[标本]新鲜液化精液。

[操作]

1、计算精子活动率 取液化精液1滴于载玻片上,加盖玻片,高倍镜下观察100个精子,计数有尾部活动精子数,计算其百分率,即精子活动率。

2、观察精子活动力  在观察活动率的同时,观察精子活动的强度,将精子活动分为a、b、c、d四个级别,即精子活动力。a级:精子呈前向快速运动;b级:缓慢或呆滞的前向运动;c级:非前向运动;d级:死精子。

3、染色  若不活动精子大于50%,可进行体外活体染色,以鉴别其死活。取新鲜液化精液和伊红Y染液1滴于载玻片上,混匀,1min后推成薄片,自然干燥后于显微镜(高倍镜)下观察。死精子呈红色,活精子不着色。观察100个精子,以不着色精子的百分率报告精子活率。

[注意事项]

1、排精后1h内送检,时间过长,精子活动率和活动力减低。

2、检查时注意保温,温度过低,精子活动率、活动力下降。

实验二 精子计数

[目的]掌握精子计数的方法

[原理]采用碳酸氢钠破坏精液的粘稠度,甲醛固定精子,然后充计数池,显微镜下计数一定范围内的精子数,换算成每升精液中的精子数。

[器材]显微镜,血红细胞计数板,小试管。

[试剂]精子稀释液。

[标本]新鲜精液化精液。

[操作]

1、取稀释液  取精子稀释液0.38ml于小试管内。

2、加精液 加入混匀的液化精液20ul,充分混匀。

3、充池  取1滴精子悬液充入计数池内,静置3~5min。

4、观察  高倍镜下计数中央大方格内四角及中央5个中方格内的精子数。

5、计算

精子计数=5个中方格内精子数×109/L

精子总数=精子数/L×精液量(ml)×10-3

[注意事项]

1、精子数量变异较大,较准确的计数应在2~3个月内分别取3份或更多的精液标本检查。出现1次异常结果,应间隔7d后再复查,反复查2~3次后方能得出较准确结果。

2、如常规检查未发现精子,应离心后取沉淀物检查,若仍无精子才能确定为精子症。

实验三 精子形态检查

[目的]掌握精子正常形态及其检查方法。

[原理]正常精子形似蝌蚪,分头、体、尾三部分,长约50~60um。头部呈椭圆形,尾长可弯曲,经过瑞特染色后,显微镜下观察100~200个精子,观察形态正常和异常精子数及其所占的比例。

[器材]显微镜,载玻片,香柏油。

[试剂]Wright染液。

[标本]新鲜液化精液。

[操作]

1、涂片并染色  取液化精液1滴于载玻片上,直接涂片,自然干燥后行Wright染色。

2、观察结果  油镜下计数200个精子,观察有无异形精子,同时计数精子凝集情况。

3、结果判断 

(1)头部异常:有大头、小头、尖头、双头、梨形头、无定形头及头部边缘不齐等。

(2)体部异常:有分支、双支、体部肿胀甚至消失。

(3)尾部异常:有双尾、卷曲尾、断尾、尾部消失等。

[注意事项]

1、观察精子形态的同时也要注意有无红细胞、白细胞、上皮细胞和肿瘤细胞等。

2、注意观察有无未成熟的生殖细胞,如发现未成熟生殖细胞,应计数200个生殖细胞(包括精子),计算其未成熟生殖细胞百分率。

3、如果精子数>10×109/L,可直接涂片检查;如果<10×109/L,则应将精液离心15~20min后,取沉淀物涂片检查。

4、衰老的精子体部也可膨大并有被膜,不宜列入异形精子。

实验四 阴道分泌物检查

一、阴道分泌物理学检查

[目的]掌握阴道分泌物的理学检查的方法及内容。

[原理]通过理学检查方法对新鲜阴道分泌物进行检查,以观察其颜色和pH变化。

[器材]消毒棉拭子,pH试纸。

[标本]新鲜阴道分泌物。

[操作]

1、观察外观  肉眼仔细观察阴道分泌物的颜色。

2、测定酸碱度  用pH试纸检测其酸碱度。

二、阴道分泌物显微镜检查

[目的]掌握阴道分泌物显微镜检查的方法及内容。

[原理]利用显微镜对阴道分泌物湿片和染色涂片检查,观察其清洁度和有无特殊细菌及细胞等。

[器材]显微镜,载玻片。

[试剂]

1、2.5mol/L KOH溶液。

2、生理盐水。

3、革兰染液。

[标本]新鲜阴道分泌物

[操作]

1、湿片检查

(1)取阴道分泌物后滴加1滴生理盐水,制成涂片。

(2)低倍镜观察后,再用高倍镜检查,根据上皮细胞、白细胞(或脓细胞)、杆菌、球菌的多少,判断阴道清洁度。

(3)检查清洁度的同时,高倍镜观察有无阴道毛滴虫。

(4)于阴道分泌物涂片上加1滴2.5mol/LKOH,混匀后加盖玻片,先用低倍镜观察言观色,若发现有菌丝样物,再换高倍镜,检查有无真菌。

2、染色涂片检查

(1)取阴道分泌物涂片,自然干燥后,行革兰染色。

(2)显微镜下检查有无致病菌。

3、结果判断  阴道分泌物清洁度结果判断

[注意事项]

1、取材要准确,并及时送检。否则会导致阴道毛滴虫死亡、淋病奈瑟菌自溶。

2、阴道清洁度检查时,标本必须新鲜,防止污染。

3、检查阴道毛滴虫时应注意保温。

4、湿片检查阴性时,应再用Wright染色或革兰染色,一次阴性不能排除诊断。

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