小鹅瘟的确诊方法有哪些?
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实验室诊断小鹅瘟的诊断是根据
流行病学、临诊症状和病理变化进行的。1--3周龄的雏鹅群大批发病死亡，发病率和病死率极高，而青年鹅、成年鹅和其他家禽均未发生；患病雏鹅以排黄白色或黄绿色水样稀粪为主要特征，肠管内有条状的脱落假膜或在小肠末端发牛特有的栓子阻塞于肠管。但要做出明确的诊断结论，需要进行实验室病毒分离鉴定以及血清学诊断。(1)病原分离及鉴定①病毒分离。病料及处理：无菌手续取患病雏鹅、死亡雏鹅的肝、胰、脾、肾和脑等内脏器官病料，放置灭菌的玻瓶冻结保存作病毒分离用。方法一：先将病料组织剪碎、磨细，用灭菌生理盐水，或灭菌PBS液作1：5～l：10稀释，经3 000转／分，离心30分钟，取上清液加入抗生素，使之每毫升组织液含有
青霉素、
链霉素各1 000单位，于37℃温箱作用30分钟，经细菌检验为阴性者作病毒分离材料。方法二：将上述离心的上清液，经0.22微米滤膜过滤除菌的组织液加入抗生素，使之每毫升含有青霉素、链霉素各500单位，经细菌检验为阴性者作为病毒分离材料。方法三：将上述离心的上清液，按4：l加入分析纯氯仿充分混匀后放置37℃温箱作用60分钟或4℃冰箱过夜，经3 000转／分，离心30分钟，取上清液加入抗生素，使之每毫升含有青霉素、链霉素各1 000单位，于37℃温箱作用30分钟，经细菌检验为阴性者作为病毒分离材料。胚胎接种（鹅胚或番鸭胚)：将上述病毒分离材料接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔接种0.2毫升，置37～38℃孵化箱内继续孵化，每天照胚2～4次，观察9天，一般经5～9天大部分胚胎死亡。在72小时以前死亡的胚胎废弃，72小时以后死亡的鹅胚取出，放置4～8℃冰箱内冷却收缩血管。用无菌手续吸取绒尿液保存和做无菌检验，并观察胚胎病变。无菌的绒尿液冻结保存作传代和检验用。胚胎病变：由本病毒致死的鹅胚和番鸭胚具有相同的大体肉眼病变。绒尿膜增厚，全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点，胚肝充血及边缘出血，心脏和后
脑出血，头部皮下及两肋皮下
水肿。接种后7天以上死亡的鹅胚和番鸭胚胚体发育停顿，胚体小。②病毒鉴定。用鹅胚绒尿液分离病毒与已知抗小鹅瘟病毒标准血清，或抗小鹅瘟病毒单克隆抗体用易感鹅胚做中和试验，或用易感雏鹅做中和试验；用已知抗小鹅瘟病毒标准血清用易感雏鹅做保护试验；也可应用琼脂扩散试验、ELISA、荧光抗体等方法鉴定病毒。 (2)病原与抗体检测①琼脂扩散试验。a．材料准备。标准抗血清：标准阳性血清、抗小鹅瘟病毒单克隆抗体、标准阴性血清，均由指定单位提供。标准抗原：标准琼扩抗原，由指定单位提供。被检血清：无菌手续采集血液，分离血清，按0.01%量加入硫柳汞防腐，冻结保存待检。被检琼扩抗原制备：将分离毒株鹅胚绒尿液，经3000转／分，离心30分钟，取上清液加入等量三氯甲烷（氯仿)振摇30分钟后，经3000转／分，离心30分钟。吸取上清液装入透析袋，置于有干燥硅胶的密闭玻璃缸（或玻璃瓶)内数小时，或至完全干燥为止，也可置40%聚乙二醇中浓缩（约12小时)。加适量灭菌无离子水于透析袋内，使之达到1/40～1/50原绒尿液量，待完全溶解后吸出置无菌小瓶内加入0.01%硫柳汞防腐，冻结保存，即为被检琼扩抗原。琼脂板制备：取1.0克优质琼脂或琼脂粉加100毫升、pH7.8的8%
氯化钠溶液，加热使其完全溶解后加入1毫升1%的硫柳汞溶液，混匀制成3毫米厚的平板，待冷却后打孔即成。b．操作方法。检测抗体：打孔：将制备好的琼脂板按模板用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3毫米，孔距4毫米，用溶化琼脂补孔底。加样：中央孔加入标准琼扩抗原，1孔、4孔加入标准阳性血清，其他孔分别加入被检血清，或1孔加入标准阳性血清，其他孔分别加入被检倍增稀释血清，各孔均以加满而不溢出为度。将加样后的琼脂板放入填有湿纱布的盒内，置20～25℃室温或37℃温箱，经24小时初判，72小时终判。结果判定：当标准阳性血清孔与抗原孔之问形成清晰沉淀线时，被检血清孔与抗原孔之间也出现沉淀线，且与标准阳性血清沉淀线末端相吻合，即将被检血清判为阳性。当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时，当被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线出现时，即将被检血清判为阴性。当被检血清最高稀释度孔与抗原孔之问形成清晰沉淀线时，即判为被检血清琼扩效价。检测抗原： 打孔：同操作方法。加样：中央孔加标准阳性琼扩血清，l孔、4孔加入标准琼扩抗原，其他孔加入被检抗原。各孔均以加满而不溢出为度。将加样后的琼脂板放人填入湿纱布的盒内，置20～25℃室温或37℃温箱，经24小时初判，72小时终判。结果判定：当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀时，被检抗原孔与阳性血清-之问也出现沉淀线，且与标准抗原沉淀线末端相吻合，即将被检抗原判为阳性。当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀时，被检抗原孔与阳性血清孔之问无沉淀线出现时，即将被检抗原判为阴性。②中和试验（鹅胚中和试验)。a．材料准备。标准抗血清：标准阳性血清、抗小鹅瘟病毒单克隆抗体、标准阴性血清均由指定单位提供。标准毒株：标准小鹅瘟病毒株（SYC61株)，由指定单位提供。被检毒株：为鹅胚分离绒尿液毒，并进行毒价滴定。被检血清：无菌手续采集血液，分离血清，经56℃30分钟灭活，- 20℃保存备用。稀释液：可采用灭菌Hank's液或灭菌生理盐水。b．病毒毒价滴定：先将小鹅瘟鹅胚绒尿液毒用每毫升含有青霉素和链霉素各1 000单位灭菌稀释液做10倍系列稀释，从10-1～10-8，每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔0.2毫升，置37-38℃孵化箱继续孵化，观察9天。每天照蛋2～4次，剔除接种后72小时内死亡鹅胚，结果按Karber公式计算鹅胚半数致死量(ELD50)。小鹅瘟鹅胚适应毒ELD50为l0 7.0左右。c．操作方法：固定病毒稀释血清法：先将小鹅瘟胚绒尿液毒用灭菌稀释液稀释，使每一单位剂量含有200ELD50，与等量递增稀释的血清混合，置37℃温箱作用60分钟。每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔0.2毫升。同时设lOOELD50病毒液对照，置37-38℃孵化箱继续孵化，观察9天，记录每组鹅胚的存活数。结果判定：1：8以上判为阳性，1：2以下判为阴性，1:4为疑似反应。固定血清稀释病毒法：先将小鹅瘟胚绒尿液毒用灭菌稀释液做10倍递增系列稀释，分装到两列灭菌试管中。第一列分别加等量阴性血清混合作为对照组，第二列分别加等量被检血清混合，置37℃温箱作用1小时。每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚绒尿腔0.2毫升。置37～38℃孵化箱继续孵化，观察8天，记录每组鹅胚的存活数，计算ELD50和中和指数。结果判定：中和指数为对照组与被检组ELD50的差数的反对数。中和指数<10为阴性，10～49为可疑，50以上为阳性。③保护试验。用已知抗小鹅瘟血清注射易感雏鹅，然后用待检病毒攻击，或用被检血清注射易感雏鹅，然后用已知小鹅瘟强毒攻击，根据被保护的情况确定被检病毒。5～10只5日龄左右的易感雏鹅或易感雏番鸭，每只雏禽皮下注射0.5毫升抗小鹅瘟血清或康复血清。血清注射后6～12小时分别注射含有1 000单位青霉素、链霉素的Hank's液或用生理盐水稀释的病毒，每雏100LD50剂量。前者用被检的鹅胚强毒，或肝脏病料；后者用已知小鹅瘟鹅胚强毒，观察10天，记录雏鹅死亡数及检验病变。试验时加设100LD50组和正常饲养对照组，每组均应严格分开饲养，防止相互感染造成试验失败。④琼脂扩散抑制试验。琼扩抗原加入相应抗体，则抗原和抗体相结合而抑制沉淀带的出现。如加入抗体过多，抗原和抗体结合后还有过剩抗体，又可与抗原相结合出现沉淀带。此法可检测抗原成分、鉴定沉淀带性质以及抗原抗体结合的最适比例。被检血清和已知抗小鹅瘟血清分别用无菌PBS液做倍增稀释，并将其各分为4份。其中2份分别加入等量已知小鹅瘟琼扩抗原和被检琼扩抗原，另2份分别加入等量PBS液代替抗原，混匀后于37摄氏度温箱作用1小时。按琼扩试验诊断方法进行试验。
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实验室检测
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通过实验室检测确诊
