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鹅病症状描述:小鹅瘟的确诊方法有哪些?
病毒病 更新:2017/6/28 字体:
小鹅瘟的确诊方法有哪些?
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实验室诊断小鹅瘟的诊断是根据流行病学、临诊症状和病理变化进行的。1--3周龄的雏鹅群大批发病死亡,发病率和病死率极高,而青年鹅、成年鹅和其他家禽均未发生;患病雏鹅以排黄白色或黄绿色水样稀粪为主要特征,肠管内有条状的脱落假膜或在小肠末端发牛特有的栓子阻塞于肠管。但要做出明确的诊断结论,需要进行实验室病毒分离鉴定以及血清学诊断。(1)病原分离及鉴定①病毒分离。病料及处理:无菌手续取患病雏鹅、死亡雏鹅的肝、胰、脾、肾和脑等内脏器官病料,放置灭菌的玻瓶冻结保存作病毒分离用。方法一:先将病料组织剪碎、磨细,用灭菌生理盐水,或灭菌PBS液作1:5~l:10稀释,经3 000转/分,离心30分钟,取上清液加入抗生素,使之每毫升组织液含有青霉素链霉素各1 000单位,于37℃温箱作用30分钟,经细菌检验为阴性者作病毒分离材料。方法二:将上述离心的上清液,经0.22微米滤膜过滤除菌的组织液加入抗生素,使之每毫升含有青霉素、链霉素各500单位,经细菌检验为阴性者作为病毒分离材料。方法三:将上述离心的上清液,按4:l加入分析纯氯仿充分混匀后放置37℃温箱作用60分钟或4℃冰箱过夜,经3 000转/分,离心30分钟,取上清液加入抗生素,使之每毫升含有青霉素、链霉素各1 000单位,于37℃温箱作用30分钟,经细菌检验为阴性者作为病毒分离材料。胚胎接种(鹅胚或番鸭胚):将上述病毒分离材料接种6枚12日龄易感鹅胚,每胚绒尿腔接种0.2毫升,置37~38℃孵化箱内继续孵化,每天照胚2~4次,观察9天,一般经5~9天大部分胚胎死亡。在72小时以前死亡的胚胎废弃,72小时以后死亡的鹅胚取出,放置4~8℃冰箱内冷却收缩血管。用无菌手续吸取绒尿液保存和做无菌检验,并观察胚胎病变。无菌的绒尿液冻结保存作传代和检验用。胚胎病变:由本病毒致死的鹅胚和番鸭胚具有相同的大体肉眼病变。绒尿膜增厚,全身皮肤充血,翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点,胚肝充血及边缘出血,心脏和后脑出血,头部皮下及两肋皮下水肿。接种后7天以上死亡的鹅胚和番鸭胚胚体发育停顿,胚体小。②病毒鉴定。用鹅胚绒尿液分离病毒与已知抗小鹅瘟病毒标准血清,或抗小鹅瘟病毒单克隆抗体用易感鹅胚做中和试验,或用易感雏鹅做中和试验;用已知抗小鹅瘟病毒标准血清用易感雏鹅做保护试验;也可应用琼脂扩散试验、ELISA、荧光抗体等方法鉴定病毒。 (2)病原与抗体检测①琼脂扩散试验。a.材料准备。标准抗血清:标准阳性血清、抗小鹅瘟病毒单克隆抗体、标准阴性血清,均由指定单位提供。标准抗原:标准琼扩抗原,由指定单位提供。被检血清:无菌手续采集血液,分离血清,按0.01%量加入硫柳汞防腐,冻结保存待检。被检琼扩抗原制备:将分离毒株鹅胚绒尿液,经3000转/分,离心30分钟,取上清液加入等量三氯甲烷(氯仿)振摇30分钟后,经3000转/分,离心30分钟。吸取上清液装入透析袋,置于有干燥硅胶的密闭玻璃缸(或玻璃瓶)内数小时,或至完全干燥为止,也可置40%聚乙二醇中浓缩(约12小时)。加适量灭菌无离子水于透析袋内,使之达到1/40~1/50原绒尿液量,待完全溶解后吸出置无菌小瓶内加入0.01%硫柳汞防腐,冻结保存,即为被检琼扩抗原。琼脂板制备:取1.0克优质琼脂或琼脂粉加100毫升、pH7.8的8%氯化钠溶液,加热使其完全溶解后加入1毫升1%的硫柳汞溶液,混匀制成3毫米厚的平板,待冷却后打孔即成。b.操作方法。检测抗体:打孔:将制备好的琼脂板按模板用打孔器打孔,并挑出孔中的琼脂。中心1孔,周围6孔,孔径3毫米,孔距4毫米,用溶化琼脂补孔底。加样:中央孔加入标准琼扩抗原,1孔、4孔加入标准阳性血清,其他孔分别加入被检血清,或1孔加入标准阳性血清,其他孔分别加入被检倍增稀释血清,各孔均以加满而不溢出为度。将加样后的琼脂板放入填有湿纱布的盒内,置20~25℃室温或37℃温箱,经24小时初判,72小时终判。结果判定:当标准阳性血清孔与抗原孔之问形成清晰沉淀线时,被检血清孔与抗原孔之间也出现沉淀线,且与标准阳性血清沉淀线末端相吻合,即将被检血清判为阳性。当标准阳性血清孔与抗原孔之间形成清晰沉淀线时,当被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线出现时,即将被检血清判为阴性。当被检血清最高稀释度孔与抗原孔之问形成清晰沉淀线时,即判为被检血清琼扩效价。检测抗原: 打孔:同操作方法。加样:中央孔加标准阳性琼扩血清,l孔、4孔加入标准琼扩抗原,其他孔加入被检抗原。各孔均以加满而不溢出为度。将加样后的琼脂板放人填入湿纱布的盒内,置20~25℃室温或37℃温箱,经24小时初判,72小时终判。结果判定:当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀时,被检抗原孔与阳性血清-之问也出现沉淀线,且与标准抗原沉淀线末端相吻合,即将被检抗原判为阳性。当标准抗原孔与阳性血清孔之间形成清晰沉淀时,被检抗原孔与阳性血清孔之问无沉淀线出现时,即将被检抗原判为阴性。②中和试验(鹅胚中和试验)。a.材料准备。标准抗血清:标准阳性血清、抗小鹅瘟病毒单克隆抗体、标准阴性血清均由指定单位提供。标准毒株:标准小鹅瘟病毒株(SYC61株),由指定单位提供。被检毒株:为鹅胚分离绒尿液毒,并进行毒价滴定。被检血清:无菌手续采集血液,分离血清,经56℃30分钟灭活,- 20℃保存备用。稀释液:可采用灭菌Hank's液或灭菌生理盐水。b.病毒毒价滴定:先将小鹅瘟鹅胚绒尿液毒用每毫升含有青霉素和链霉素各1 000单位灭菌稀释液做10倍系列稀释,从10-1~10-8,每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚,每胚绒尿腔0.2毫升,置37-38℃孵化箱继续孵化,观察9天。每天照蛋2~4次,剔除接种后72小时内死亡鹅胚,结果按Karber公式计算鹅胚半数致死量(ELD50)。小鹅瘟鹅胚适应毒ELD50为l0 7.0左右。c.操作方法:固定病毒稀释血清法:先将小鹅瘟胚绒尿液毒用灭菌稀释液稀释,使每一单位剂量含有200ELD50,与等量递增稀释的血清混合,置37℃温箱作用60分钟。每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚,每胚绒尿腔0.2毫升。同时设lOOELD50病毒液对照,置37-38℃孵化箱继续孵化,观察9天,记录每组鹅胚的存活数。结果判定:1:8以上判为阳性,1:2以下判为阴性,1:4为疑似反应。固定血清稀释病毒法:先将小鹅瘟胚绒尿液毒用灭菌稀释液做10倍递增系列稀释,分装到两列灭菌试管中。第一列分别加等量阴性血清混合作为对照组,第二列分别加等量被检血清混合,置37℃温箱作用1小时。每个稀释度接种6枚12日龄易感鹅胚,每胚绒尿腔0.2毫升。置37~38℃孵化箱继续孵化,观察8天,记录每组鹅胚的存活数,计算ELD50和中和指数。结果判定:中和指数为对照组与被检组ELD50的差数的反对数。中和指数<10为阴性,10~49为可疑,50以上为阳性。③保护试验。用已知抗小鹅瘟血清注射易感雏鹅,然后用待检病毒攻击,或用被检血清注射易感雏鹅,然后用已知小鹅瘟强毒攻击,根据被保护的情况确定被检病毒。5~10只5日龄左右的易感雏鹅或易感雏番鸭,每只雏禽皮下注射0.5毫升抗小鹅瘟血清或康复血清。血清注射后6~12小时分别注射含有1 000单位青霉素、链霉素的Hank's液或用生理盐水稀释的病毒,每雏100LD50剂量。前者用被检的鹅胚强毒,或肝脏病料;后者用已知小鹅瘟鹅胚强毒,观察10天,记录雏鹅死亡数及检验病变。试验时加设100LD50组和正常饲养对照组,每组均应严格分开饲养,防止相互感染造成试验失败。④琼脂扩散抑制试验。琼扩抗原加入相应抗体,则抗原和抗体相结合而抑制沉淀带的出现。如加入抗体过多,抗原和抗体结合后还有过剩抗体,又可与抗原相结合出现沉淀带。此法可检测抗原成分、鉴定沉淀带性质以及抗原抗体结合的最适比例。被检血清和已知抗小鹅瘟血清分别用无菌PBS液做倍增稀释,并将其各分为4份。其中2份分别加入等量已知小鹅瘟琼扩抗原和被检琼扩抗原,另2份分别加入等量PBS液代替抗原,混匀后于37摄氏度温箱作用1小时。按琼扩试验诊断方法进行试验。
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实验室检测
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通过实验室检测确诊
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