(二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法
(1)固定:通常将细胞培养在盖玻片或塑料薄膜上,可将盖玻片取出,倾去培养液,用4%多聚甲醛液固定2~4h后,依组织切片处理法进行ISHH实验。也有在4%多聚甲醛室温固定20min后,由低浓度30%,50%,70%酒精各3min ,保留在新鲜配制的70%酒精中,4℃,备用。
(2)重回到水:50%,30%酒精3min,无菌重蒸水2×3min,然后置入PBS含5mmol/l MgCl2 10min,室温(配制法:200ml PBS, 1ml MgCl2)。
(3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4:室温10min(0.1mol/L 甘氨酸,0.2mol/l Tris(配制法:1.5mg甘氨酸和20ml Tris,应用重蒸水制成200ml)。
以后步骤同(一)组织切片法。
二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用
(一)光敏生物素标记cRNA探针的应用
以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针,使其最终浓度为0.5~1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素(1μg/μl)混合。在150瓦卤素灯下,距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素,再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针,将其溶于适量的灭菌双蒸水,用紫外分光光度计测探针的光密度(详第十九章 ),其最佳工作浓度为2μg/ml。
切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节 。
光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序:
(1)石蜡切片脱蜡入水后,置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min;冰冻切片直接入PBS冲洗5min。
(2)0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。
(3)0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。
(4)蛋白酶K1μg/ml(0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保温30min。
(5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
(6)0.1mol/l PBS冲洗2×3min。
(7)0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
(8)2×SSC冲洗10min(1×SSC:0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠)。
(9)取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上,如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min,马上放入冰浴中冷却,然后再用。
(10)盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜,入温盒43℃保温12~16h。
(11)4×SSC洗脱盖片,并在同一液中37℃漂洗10~30min。
(12)2×SSC(含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针)冲洗30min,37℃。
(13)1×SSC,0.1×SSC,37℃各漂洗10~30min。
(14)0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。
(15)3%BSA(0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保温30min。
(16)Avidin –AKP(碱性磷酸酶)(1:500~1:100,0.4%Triton X-100 PBS配)室温1~3h。
(17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
(18)TSM1冲洗2×5min。
(19)TSM2冲洗2×5min。
(20)硝基四氮唑蓝(NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)0.2mg/ml混合液显色,室温,暗处3h。
(21)20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。
(22)甘油明胶直接封片。
结果:杂交阳性部位着蓝黑色。
组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒,实验者需戴手套。