（二)基本操作步骤
组织处理及预杂交等步骤与本章 中叙述的放射性同位素标记cRNA探针相同，但由于地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，我们在基本方法中仍较详细的叙述其操作过程。
1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm)最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。
在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper)包被，内加少许干燥剂（变色硅胶)。
下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1)PBS洗2×3min。
（2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。
其它切片暂放于PBs 内。
RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml)在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。
（3)蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。
（4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
（5)在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6)以PBs 漂洗2×3min。
（7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，以封闭非特异性结合部位。
（8)2×SSC漂洗15min。
2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml)的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃，16～18h或过夜。
3．显示
（1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。
（2)在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。
（3)拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释)，孵育2h，室温。
（4)缓冲液1漂洗3×3min。
（5)浸入缓冲液210min室温。
（6)浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定)，底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。
（7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。
（8)复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁（又称派咯宁丫)（pyronin 丫)10～30s。
（9)流水洗5～10min，直至水无色为止。
（10)在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。
几点说明
①缓冲液1，2，3配制法见附录。缓冲液1中BSA用量大，价贵，如无法负担可略去。
②切片处理过程可采取漂浮法或载片染色法，载片染色适用于切片数数量较少时，可用液体覆盖于切片表面进行孵育，漂洗在烧杯内进行。如切片多，可将载片置于方形的染色缸（staining jar)内，将冲洗液加入缸内，如有振荡器在漂洗中稍加震荡更有助于减低背景染色。漂浮法适用于切片数量大量，将切片置于凹形碟内，或染色缸内。漂浮法的优点是节 约试剂用量，切片两面均可接触反应液，有利于信号的增强。
③在底物中孵育时间过长会产生弱强的非特异性染色，有时甚至误为阳性反应。解决方法一是设置对照片，二是对非特异性染色加以区别。非特异性染色与特异性染色的主要区别点在于后者有结构性定位，而前者系无结构性定位，常在切片边缘或细胞密集处呈现较强的颜色反应。
④在组织前处理中应严格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫细胞化学一样，自始至终应保持切片的湿润，勿令其干燥。
