第四部分 非特异性免疫试验
机体抵抗病原微生物感染的免疫机制主要包括非特异性免疫与特异性免疫，其中非特异性免疫(亦称www.med126.com固有免疫)是机体对抗病原微生物感染的第一道防线，包括：皮肤的机械阻挡作用；黏膜可分泌许多液体，如泪液、唾液、肠液等，其中含有溶菌酶可溶解和杀死细菌；正常血清中含有许多抗菌物质，如补体系统、乙型溶素等，可杀死革兰氏阴性或阳性菌；血液中的中性粒细胞和组织中的巨噬细胞对外来异物有吞噬和消化作用。非特异性免疫生来即有，作用广泛，无专一性，不仅产生非特异抗感染免疫作用，而且在特异性免疫应答过程中也起重要作用。
实验一 溶菌酶的溶菌作用
【原理】
溶菌酶主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种分子量约为14.7kDa的碱性蛋白质，属乙酰氨基多糖酶，不耐热。由于它的高等电点(pH11.0)，能与细菌牢固结合，从而水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌死亡或裂解，主要作用于革兰阳性细菌，溶菌酶还有激活补体和促吞噬作用。
溶菌酶广泛存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻腔分泌物及血清等体液中，检测体液溶菌酶水平在一定程度上反映单核巨噬细胞系统的功能状态。
溶菌酶的溶菌活性可通过对革兰阳性微球菌(MicrococusLysodeikticus)的裂解作用进行测定。本实验介绍纸片法进行唾液溶菌酶溶菌活性的测定。
【材料】
1．无菌pH6.4、1/15mol／L PBS，5N KOH溶液，溶菌酶标准品。
2．微球菌普通琼脂斜面26～36h培养物。
3．受检者唾液。
4．3%琼脂(用pH6.4、1／15mol／L PBS配制)。
5．lml、5ml无菌吸管，无菌毛细吸管、平皿、无菌滤纸片(直径4mm)、塑料小杯、小镊子等。
【方法】
1．含微球菌琼脂平板的制备 取无菌溶化的3%琼脂10ml，待冷至60～70℃时加入5ml预热的微球菌菌液，迅速混匀，倾注于无菌平皿内，平放待凝。
2．收集唾液标本置于塑料小杯内。
3．溶菌酶标准品的配制 称取溶菌酶干粉5mg，使其溶解于0.15mol／L pH6.4磷酸盐缓冲液5ml内，即获1000ug／ml溶菌酶溶液。然后将其作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40和1∶80倍比稀释，成为每毫升含200ug、100ug、50ug、25ug和12.5ug的标准溶菌酶液。
4．取滤纸片分别于标准溶菌酶液，待检标本(唾液)和生理盐水(阴性对照)中浸透。
5．用记号笔在含微球菌的琼脂平板底面先做好标记，再用小镊子分别夹取含不同浓度溶菌酶的滤纸片及含待测标本或对照的纸片，小心平贴于琼脂表面。
6．置平板于37℃温箱18～24h后观察结果。
【结果】
观察滤纸片周围是否出现透明的溶菌环。如有，用游标尺测量溶菌环直径。以标准品溶菌酶的浓度为横坐标，相应浓度溶菌环直径的均值为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。并根据检测样品的溶菌环直径，从标准曲线上找出其相应溶菌酶浓度，乘以样品的稀释倍数，则可对标本中所含溶菌酶做定量测定。
【注意事项】
1．滤纸片应浸有足够的标准品或样品，但它们不能成滴溢出。
2．最好在每个琼脂平板上都放有不同浓度的标准品滤纸片，可以尽量减少平板间的结果误差。
【思考题】
1．溶菌酶的溶菌作用有何生物学意义?
2．为什么要对溶菌酶进行定量测定?
实验二 补体参与的试验
补体是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活化后具有酶活性的蛋白质，广泛参与机体抗微生物防御反应以及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应系统和效应放大系统。
一、溶血素效价的测定
【原理】
小鼠或家兔等动物经绵羊红细胞(SRBC)免疫后血清中可出现抗SRBC的抗体。采集免疫动物血液分离血清，即可获得抗SRBC的抗血清。用SRBC与相应抗血清混合时，当有补体存在时，在一定条件下，SRBC被破坏溶解，故抗SRBC抗体又称为溶血素。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀释度称溶血素的效价。
【材料】
1．抗体 含溶血素血清(用生理盐水1∶100稀释)。
2．抗原 2%SRBC悬液。
3．补体 取自豚鼠新鲜血清，生理盐水1∶30稀释。
4．其他 37℃水浴箱、试管、吸管、生理盐水等。
【方法】
按表4—1加入各试验材料。
表4-1 溶 血 素 单 位 滴定单位：ml
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理盐水 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
含溶血素 ↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↗弃0.5
(1∶100)血清 0.1 → 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
血清稀释度 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 卫生资格考试网1/16000 1/32000 1/64000 1/128000
补体(1∶30) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2%SRBC 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
摇匀后置于37℃水浴箱中30min
结 果
【结果】
将各管发生溶血的情况记录于上表“结果”一项。以“完全溶血”“不完全溶血”“完全不溶血”三个标准来判断。完全溶血指试管中绵羊红细胞全部被破坏，试管中的溶液呈均匀红色，清亮透明，试管底无红细胞沉积。不完全溶血指绵羊红细胞部分被破坏，试管中的溶液呈红色半浑浊，可见部分红细胞沉于管底。完全不溶需是指没有绵羊红细胞破坏，试管中的溶液呈红色浑浊，可见部分红细胞沉于管底。第9管(对照管)必需是“完全不溶血”时前面各管的结果才有意义。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀释度即为溶血素的效价，若溶血素效价为1∶8000，则8000倍稀释的溶血素为1单位。做补体结合试验时常用0.2ml中含2个溶血素单位的稀释液，可取1∶100的溶血素lml加生理盐水39ml即得。
【注意事项】
1．补体的血清必须新鲜。
2．SRBC用前一定要摇匀。
【思考题】
溶血素破坏红细胞为什么必须有补体参加？不加补体会出现什么结果？
二、总补体溶血活性测定(CH50测定)
【原理】
CH50测定(total hemolytic complement assay，CH50 assay)是利用补体能使溶血素致敏的绵羊红细胞(致敏的绵羊红细胞即绵羊红细胞与相应抗体形成的免疫复合物)发生溶血，当致敏红细胞浓度恒定时，在一定范围内溶血程度与补体的量及活性呈正比例关系。因此，以溶血程度为纵坐标，补体量为横坐标绘图，可得“S”型曲线（如图4-1)，曲线两端平坦，补体量的增减与溶血程度影响不大，而在曲线中段（50%溶血附近)曲线最陡，几乎成一垂直线，此时补体量的细微变化可引起溶血程度的明显改变，故取50%溶血为终点观察指标，即以引起50%溶血的最小血清量作为一个CH50单位。临床上，CH50测定可用于某些超敏反应性疾病的辅助诊断，也可作为观察病情变化的指标。
图4-1 CH50测定
【材料】
1．缓冲盐水(pH7.4)
⑴ 10×贮备液 NaCl 75g、lmol／L HCl 177ml、三乙醇胺28ml、MgCl2•6H2O 1.0g、CaCl2•2H2O 0.2g。先将NaCl溶于700ml蒸馏水中，加入HCl及三乙醇胺，MgCl2及CaCl2分别用2ml蒸馏水溶解后，逐一缓慢加入，再用蒸馏水加至1000ml。4℃保存备用。
⑵ 应用液 取1份贮备液，加9份蒸馏水，4℃保存待用。
2．2%SRBC悬液 新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血(4℃可保存3周)，生理盐水洗2次，第3次用缓冲盐水，离心2000rpm，10min。压积细胞用缓冲盐水配成2%悬液。为使红细胞浓度标准化，可将2%细胞悬液用缓冲盐水稀释25倍，于分光光度计(542nm)测定其透光率(以缓冲盐水校正透光率至100%)，每次试验用红细胞浓度(透光率)必须一致。
3．溶血素按效价以缓冲盐水稀释至2单位 (如效价为1∶8000，使用时按1∶4000稀释) 。
4．致敏SRBC 2%SRBC加等量2单位溶血素，混匀置37℃水浴10min。
5．待检血清。
6．试管、吸管、离心机、37℃水浴箱、分光光度计等。
【方法】
1．取待检血清0.2ml，加缓冲盐水3.8ml，使成1∶20稀释液。
2．取干净试管10支，按表4—2所示加入各试剂，混匀，试管置37℃水浴30min。
3．50%溶血标准管 于2ml 2%SRBC悬液中加入8ml蒸馏水，混匀，使完全溶血，然后取此液体2ml加pH7.4缓冲盐水2ml，混匀后即为50%溶血管。
表4-2 CH50测定 单位：ml
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1∶20稀释血清 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 -
缓冲盐水(pH7.4) 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 1.50
2U溶血素 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2%SRBC 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
总补体CH50(U/ml) 200 133 100 80 66.5 57.1 50 44.4 40 -
【结果】
将各试验管经2500rpm，5min，用肉眼找出最接近50%溶血管的试验管后，用分光光度计(542nm，0.5cm比色杯)读该管的A542值，即可求出补体总溶血活性。此数值即用以表示血清的总补体活性。
计算：
1
血清总补体CH50(U/ml)= × 稀释倍数
引起50%溶血管血清量(ml)
假设第4管的光密度最接近标准管，则补体含量为1/0.25×20=80U/ml，表4-2中提供各管相应补体含量，可不必计算而能直接查出，第10管为空白对照管，要求不溶血。
正常参考值：50～100U／ml。
【注意事项】
1．缓冲液、致敏羊红细胞均应新鲜配制。
2．实验器材应清洁。
3．待测标本必须新鲜，应无溶血、无污染、无乳糜血。如放置2h会使补体活性下降。
4．补体的溶血活性受多种因素的影响，如绵羊红细胞浓度及致敏抗体的量等。钙、镁离子的存在可稳定溶血系统，但含量过多时，反而抑制溶血反应。
【思考题】
1．何为CH50单位？为何取50%溶血为终点观察指标？
2．血清标本放置时间长后补体活性会有何变化？
实验三 吞噬细胞吞噬作用及吞噬杀菌功能测定
病原微生物一旦突破体表防御屏障侵入机体，首先接触遍布全身的大、小吞噬细胞，它们分布于血液和组织中，并可在某些趋化因子的作用下被吸引至微生物侵入部位。吞噬细胞依据其形态大小分为两大类：一类是血液中的单核细胞及由血液游走到血管外并固定于各组织中的巨噬细胞，称为大吞噬细胞；另一类是血液中的嗜中性粒细胞称为小吞噬细胞。它们是机体非特异性免疫的重要因素。
一、巨噬细胞的吞噬作用——大吞噬现象(体外法)
【材料】
1．体重25g左右的小鼠。
2．5ml、lml无菌注射器，6号、9号针头，10ml离心管，清洁载玻片，烧杯，解剖剪，眼科镊，湿盒，解剖板，图钉，37℃水浴箱。
3．4%淀粉肉汤 称面粉3克、可溶性淀粉5克、加营养肉汤至100ml，混匀，先微火加热，不断搅拌使成糊状。再高压灭菌。临用时，与无菌营养肉汤等量混合。
4．D-Hanks液(配方见附录)。
5．生理盐水。
6．2%鸡红细胞 无菌操作抽取鸡翅静脉血，抗凝，置于离心管中，用无菌生理盐水洗3次，最后一次离心2000rpm，10min，按压积将鸡红细胞用Hanks液配成2%浓度。
7．瑞特氏染色液。
8．pH6.4～6.8磷酸盐缓冲液 20ml 1%Na2HP04，30ml 1%KH2P04，加蒸馏水至1000ml，混匀。
【方法】
1．实验前三天给小鼠腹腔内注射lml 4%淀粉肉汤。
2．实验当天给小鼠腹腔内注射Hanks液3～4ml，轻揉腹部，让小鼠活动10min。
3．眼球放血后颈椎脱臼处死小鼠，并将小鼠钉在解剖板上。
4．碘酒、酒精消毒腹部皮肤，左手持镊提起腹中部，用解剖剪在皮肤上剪5mm长的小口，将皮肤朝头尾部方向剥开，暴露腹壁。
5．用镊子提起腹壁，避开血管剪一小口，用5ml注射器(带9号针头)或毛细吸管吸取腹腔液滴于载片上，每片2～3滴，并滴加等量的2%鸡红细胞悬液，充分混匀。
6．将玻片置于湿盒内，放37℃水浴箱内35～45min，期间轻晃动玻片二次。
7．取出后，将载玻片在生理盐水中漂洗2次，洗去未吸附在玻片上的细胞。待其自然干燥。
8．用瑞特氏染色液染色
⑴ 于玻片上滴加瑞特氏染色液数滴覆盖涂片，染色l min。
⑵ 滴加相当于染色液1.5倍量的pH6.8磷酸盐缓冲液(可用蒸馏水代替)于涂片上，轻摇玻片，混匀染色液，染8～10min。
⑶ 流水冲洗，印干后用油镜观察结果。
【结果】
因巨噬细胞为贴壁生长细胞，能粘附在清洁载玻片上，故经瑞特氏染色后，镜下可见巨噬细胞呈椭圆形、肾形或马蹄形，其核较大，染色质比较疏松，染成淡紫蓝色，胞浆染成浅灰蓝色，如有吞噬作用发生，可见巨噬细胞胞浆中有一个以上的有核鸡红细胞。如果吞噬的鸡红细胞较多，则巨噬细胞核被挤到一侧，其形态不典型。随机计数100个巨噬细胞，分别计数吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数。
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数
吞噬百分率= ×100%
100个巨噬细胞
100个吞噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数
吞噬指数= ×100%
100个巨噬细胞
此外，在计数时，应同时注意鸡RBC被消化的程度，分为4级：
I级 未消化—胞浆浅红色或浅黄绿色、胞核浅紫红色。
Ⅱ级 轻度消化—胞浆浅黄绿色；胞核固缩，染成紫蓝色。
Ⅲ级 重度消化—胞浆淡染，胞核成浅灰黄色。
Ⅳ级 完全消化—巨噬细胞内只见形状似红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。
吞噬百分率和吞噬指数增高，表明机体大吞噬细胞的吞噬能力强，反之则吞噬能力弱。
【注意事项】
1．所用器材要干净。
2．越接近涂片末稍细胞数越多，故计数时应取片子的前、中、后三段计数，以提高准确性。
3．凡需要瑞特氏染色的涂片必须在空气中自然干燥后再染色，避免加热干燥。否则细胞因受热脱水而皱缩，影响吞噬现象的观察。
二、中性粒细胞的吞噬作用——小吞噬现象
（一)体内法
【材料】
1．白色葡萄球菌菌液，将白色葡萄球菌接种于营养琼脂斜面上，培养18～24h，用无菌生理盐水洗下培养物，经Mafaland比浊法配成3×108个细菌／ml的悬液备用。
2．清洁载玻片、无菌注射器(1m1)及6号、9号针头。
3．无菌肉汤。
4．小鼠(雌雄随机)体重25克左右。
5．瑞氏染色液(配制见附录)，pH6.8磷酸盐缓冲液(或蒸馏水)。
【方法】
1．于实验前1h给小鼠腹腔内注射lml肉汤，诱导浆液渗出。
2．用带6号针头的注射器向小鼠腹腔内注射白色葡萄球菌菌液lml，让小鼠活动。
3．分别在注射菌液30～45min后按前述方法处死并剖开小鼠并用带9号针头的注射器或毛细吸管抽取腹腔液涂片，自然干燥。
4．瑞特氏染色后，油镜观察。
【结果】
中性粒细胞的细胞核染成深紫红色，核分2～5叶，细胞浆染成淡粉红色，白色葡萄球菌染成深紫色。随机计数100个中性粒细胞，分别计数吞噬有细菌的吞噬细胞数和所吞噬的细菌总数，按上述公式分别计算出吞噬百分率和吞噬指数。
【注意事项】
同大吞噬现象。
（二)体外法
【材料】
1．3.8%枸橼酸钠。
2．葡萄球菌菌液。
3．清洁载玻片、无菌注射器(1m1)、6号、9号针头及无菌肉汤。
4．瑞氏染色液，pH6.8磷酸盐缓冲液(或蒸馏水)。
【方法】
1．自静脉采血0.2ml，置于含3.8%枸橼酸钠0.2ml的小试管中，混匀，防止凝血(可抽一个人血５ml抗凝，供全小班使用)。
2．取葡萄球菌菌液0.1ml，加入上述血液中，混匀。
3．37℃静置孵育30min，期间于15或20min时震荡一次。
4．取出试管，用毛细管吸取白细胞层(即沉淀红细胞的表层)，制成血膜，自然干燥。
5．瑞特氏染色后，油镜观察。
【结果】
同体内法。
【注意事项】
同大吞噬现象。
三、中性粒细胞的杀菌功能测定
——硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验
【原理】
中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗聚增，耗氧量增加，葡萄糖已糖磷酸旁路代谢的活力增强，此时如加入硝基蓝四氮唑(nitrobluetetra-Zolium，NBT)，葡萄糖分解的中间产物6-磷酸葡萄糖氧化所脱的氢可被NBT接受，NBT被还原，从淡黄色变成蓝黑色，以点状或斑块状颗粒沉积于胞浆中，这种细胞称为NBT阳性细胞。镜下检查NBT阳性细胞数量便可推知中性粒细胞的功能，临床上也可作慢性肉芽肿等吞噬细胞功能缺陷病的辅助诊断指标。
【材料】
1．清洁小试管(12×100mm)，载玻片，毛细吸管。
2．肝素抗凝的人外周血。
3．生理盐水。
4．NBT试剂 0.28%NBT生理盐水溶液0.6ml、牛血清0.5ml、生理盐水、0.3ml的混合液。
5．瑞特氏染色液。
6．37℃水浴箱等。
【方法】
1．滴加一滴肝素抗凝的人血标本于清洁载玻片上，湿盒内放置10min，在此期间中性粒细胞可粘附在载玻片上。
2．用生理盐水轻轻冲洗玻片，冲去未粘附的细胞，并用吸水纸吸去多余的水分。
3．标本上加1滴NBT试剂，放湿盒内于37℃水浴反应20min。取出载玻片，自然干燥。
4．瑞特氏染色，油镜镜检。
【结果】
中性粒细胞胞浆中出现点状或块状蓝黑色沉淀物的为NBT阳性细胞。计数100个中性粒细胞，求出NBT阳性细胞百分率。百分率愈高，表明中性粒细胞的吞噬功能越强。阳性细胞百分率可作为区别细菌性与病毒性感染的指标之一，当机体受细菌感染时，NBT阳性细胞增多，受病毒感染时，NBT反应一般正常。
【注意事项】
1．在吞噬试验过程中玻片不能干，否则吞噬作用将不能进行。
2．在染色前，玻片上的标本一定要自然干燥，不宜加热烘干，否则细胞会固缩而影响细胞形态。
3．瑞特氏染色时染液与磷酸盐缓冲液的比例一定要合适。
4．NBT染液用前要过滤，不要残留颗粒。
5．所用玻片必须干净，以避免玻璃表面杂质参与NBT的还原作用。
【思考题】
1．为什么说吞噬细胞是机体抗感染的重要防线?如果吞噬功能丧失，对机体会有什么影响?
2．吞噬百分率与吞噬指数有何异同？
3．小吞噬实验与NBT还原试验意义上有什么区别？
4．为何NBT还原试验可以区别受试者是受细菌感染还是受病毒感染?
