第三部分 细胞免疫检测技术
体外测定细胞免疫功能，首先需要从人或动物外周血获取有活性的免疫细胞，包括通过分离外周血单个核细胞获取淋巴细胞，如采用尼龙毛柱法和E花结法分离T淋巴细胞等。
实验一 免疫细胞分离技术
一、外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)包括血液中的淋巴细胞和单核细胞，PBMC是进行细胞免疫学试验最常用的细胞，目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离。
【原理】
PBMC与血液中其它血细胞的比重略有不同，红细胞、粒细胞比重较大(1.092左右)，PBMC比重较小(1.075～1.090)。将抗凝血置于一定比重(1.075～1.092)的淋巴细胞分离液之上，经一定速度离心后形成密度梯度细胞层：红细胞、粒细胞比重较大，离心后沉于管底；比重与分层液接近的PBMC，离心后密集于血浆层与分层液的界面；血小板因比重小而悬浮于血浆中，由此可获得较纯的PBMC。
【材料】
1．淋巴细胞分离液 即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin，商品名常用Isopaque或Hypaque)分层液，又名Ficoll-Hypaque分层液，比重1.077±0.001。
2．肝素抗凝剂 用Hanks液或生理盐水稀释成1000u／ml，肝素用量约为20u／1ml血。
3．Hanks液 pH7.2～7.4，无Ca2+、Mg2+（配制见附录)。
4．10%小牛血清RPMI1640（配制见附录)。
5．0.4%台酚蓝染色液 用生理盐水配制（配制见附录)。
6．血球计数板、显微镜、水平式离心机；无菌试管、毛细滴管和刻度吸管等。
【方法】
1．静脉取血1～2ml，注入盛有肝素(约20u/ml血)的无菌试管内摇匀，使血液抗凝，抗凝血用等量Hanks液稀释，并充分混匀。
2．取无菌中试管一支，自管底加入1.5～2ml淋巴细胞分离液(保持分离液液面之上管壁不受玷污)。
3．用滴管将稀释后的抗凝血沿试管壁缓慢叠加于分层液面上，应保持两种液体界面清晰。
4．平衡试管重量后置于水平式离心机内离心2000rpm，20min。离心后管内容物分为三层，上层为血浆和Hanks液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞。在上、中层界面处有一个富含单个核细胞的白色云雾状狭窄带(图3-1)。
5．将毛细吸管轻轻插到白色云雾层，吸出该层细胞，置入另一支无菌试管中，加入５倍以上体积的Hanks液洗涤细胞2～3次，每次离心1500rpm， 10min，吸弃上清。
6．最后一次吸弃上清后，加入适量含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取0.1ml细胞悬液与等量0.4%台酚蓝染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
7．细胞活力检测 死的细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率。
【结果】
4个大方格内细胞总数
PBMC浓度(细胞数／毫升悬液)＝ ×100×稀释倍数
4
活细胞数
活细胞(%) ＝ ×100%
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90%以上，收获率可达80%～90%，活细胞百分率在95%以上。
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离心前 离心后
图3-1 PBMC的分离
【注意事项】
1．将稀释的抗凝血加于分层液上时，要沿管壁缓慢加入，使分层液与血液的界面十分清晰，避免血液冲散分层液的液面而影响分离效果。
2．用毛细吸管吸取富含PBMC的白色云雾层时，动作要轻巧，最好一次吸完，避免将白色云雾层冲混。
3．操作全程应尽可能快地完成，以免死细胞数增加。活细胞百分率过低可能会影响某些试验的正常进行。
4．用淋巴细胞分离液分离PBMC时，必须使用水平式离心机，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以保持界面的清晰。
5．分离不同动物血中的PBMC，对分层液比重的要求不同，如小鼠为1.088，马为1.090等。
【思考题】
1．你认为本次试验成败的关键因素是什么？应该怎样把握？
2．现分离得到10ml单个核细胞悬液，加台酚蓝染液对倍稀释后充池计数4大方格，未着色细胞为400，若要校正活细胞浓度为1×105/ml，如何进行校正？若要同时进行细胞活力检测，应如何计数和计算？
3．上述PBMC细胞浓度的计算公式中，乘以100是什么意思？
二、T、B淋巴细胞的分离
T细胞与B细胞表面粘附特性和表面受体不同，借此可将T、B细胞分离开。常用的方法有尼龙毛分离法和E花结分离法。
(一)尼龙毛分离法
【原理】
B细胞表面凹凸不平，37℃时易粘附于尼龙毛表面，而T细胞表面光滑，无粘附作用。淋巴细胞在通过装有尼龙毛的柱时，B细胞被吸附于柱上，而T细胞不被吸附随液体流出，借此将T、B细胞分离开。
【材料】
1．标本 外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
2．试剂 Hanks液，含20%FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液。
3．器材 尼龙毛(尼龙纤维，上海化纤九厂，3D尼龙-6短纤维)、水平式离心机、10ml注射器、试管、毛细吸管等。
【方法】
1．尼龙毛柱的制备
⑴ 将尼龙毛放入烧杯内，加双蒸水煮沸10min，置尼龙毛于漏斗内沥干。重复上述过程6次，最后两次煮沸用去离子水(国产的尼龙毛需事先用0.2N盐酸浸湿数小时，取出后用双蒸水反复冲洗，再按上述方法处理)。
⑵ 称取尼龙毛，将其仔细撕开，使其松散均匀，装入注射器，高压灭菌(可根据过柱的细胞总数来确定注射器的大小和尼龙毛的重量，见表３-1)。
⑶ 用前将柱内尼龙毛用37℃预温的RPMI 1640培养液浸润，于37℃静置30min，然后分别用Hanks液和RPMI 1640培养液各5ml洗柱，流速2ml/10s。
2．1×108个PBMC重悬在1～2ml含20%FCS的RPMI 1640培养液中，将细胞悬液装柱，水平置37℃孵育60min。
3．用37℃预温的含20%FCS的RPMI 1640培养液洗脱尼龙毛柱2次，流速1滴/s。洗脱液中富含T细胞。
4．用冷的RPMI 1640培养液洗脱尼龙毛柱2次，边洗边挤压，洗脱液中富含B细胞。
【结果】
本法分离所得的T细胞纯度可达80%～90%，B细胞纯度可达70%～80%，细胞活力可达90%以上。可用荧光标记CD3单抗(或E花环形成试验)鉴定T细胞纯度，用抗Ig荧光抗体法鉴定B细胞纯度，用台酚蓝染色法鉴定细胞活力。
表３-1 装尼龙毛柱所用的注射器大小和尼龙毛重量
细胞数量 注射器容量(ml) 尼龙毛重量/注射器 尼龙毛在注射器内体积
1×108 10～12 0.6g 6ml
3×108 351.6g18ml
4×108 352.4g24ml
【注意事项】
1．尼龙毛柱的质量直接影响到分离效果。尼龙毛柱应均匀、松散、连续、不留气泡。装柱的长度应与分离的细胞成正比，一般柱高6cm，可有效滤过2～3×107个细胞。
2．用手挤压尼龙毛柱时，柱内一定要充满液体。挤压时用力要适度，用力过重，会损伤B细胞，还会将粘附力大于B细胞的单核细胞也随之挤下；用力过轻则会使B细胞流出不全。
3．冲洗尼龙毛柱时应注意溶液及环境的温度。温度过低，B细胞和单核细胞易脱落，使T细胞纯度下降，B细胞得率降低。
4．有些T细胞亚群可能滞留在柱内。
5．尼龙毛可回收利用。用过的尼龙毛可用生理盐水漂洗，然后放入0．1N盐酸内过夜，洗涤程序同前。
【思考题】
1．尼龙毛分离法分离T、B细胞的原理是什么？PBMC悬液中所含的单核细胞能否除去？为什么？
2．收集B细胞挤压尼龙毛柱时应注意什么？为什么？
3．用该法分离得到的T、B细胞如何进行纯度和活力鉴定？
（二)E花结分离法
【原理】
人类T细胞表面具有能与绵羊红细胞结合的受体(E受体，即CD2)，可与绵羊红细胞结合形成E花结。形成E花结后的T细胞，体积和比重较其它细胞大，可通过速率沉降(rate sedimentation，即体积分离)或平衡沉降(equilibrium sedimentation，即密度分离)将T细胞与B细胞加以分离。T细胞形成的E花结在37℃稳定性较差，采用还原剂AET(溴化二氨基异硫氢化物2-amino ethyl isothiourniumbromide bydrobromide)或神经氨酸酶(neuraminidase)预处理绵羊红细胞，可使T细胞形成大而稳定的花结，且花环形成快速、形成率高。经分层液密度梯度离心后，能形成E花结的T细胞沉于管底，而不能形成E花结的细胞(如B细胞和单核细胞)则在分层液的界面。将E花结形成细胞用低渗溶液处理，溶解绵羊红细胞，即可获得较纯的T细胞。
【材料】
1．阿氏液（配制见附录)、新鲜绵羊抗凝血、pH7.2的PBS、神经氨酸酶、AET、Tris-氯化胺溶液(1mol／L氯化胺以9∶1比例与0.17mol／L Tris溶液混合，调pH至7.2，过滤，4℃保存)、RPMI 1640、淋巴细胞分离液等。
2．试管、毛细吸管、水浴箱、水平离心机等。
【方法】
1．用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞(SRBC)分离T细胞
⑴ 神经氨酸酶处理的SRBC的制备 取用阿氏液对倍稀释的绵羊抗凝血20～30ml，用PBS洗涤三次(2000 rpm，5min)。末次洗涤后将绵羊红细胞重悬在20ml RPMI 1640培养基中，加入0.5ml神经氨酸酶(1u／m1)，然后置于37℃水浴中孵育30min，再用PBS洗涤SRBC两次。末次洗涤弃上清后，按10%(V/V)加RPMI 1640培养基于试管内混匀，置4℃可存放两周左右。
⑵ 分离T淋巴细胞与B淋巴细胞
将3.0～4.0×106个淋巴细胞重悬在4ml RPMI 1640培养液中，加lml 10%(V／V)神经氨酸酶处理过的绵羊红细胞悬液，混匀。将上述5ml细胞悬液叠加在3ml淋巴细胞分离液上，作密度梯度离心1500～2000rpm，20min，吸出界面云雾状细胞群，它们是未形成E花环的细胞，即B细胞；沉淀于管底的E花环阳性细胞为T细胞群体。
2．用AET处理的SRBC分离T细胞
⑴ 称取402mg AET，溶于双蒸水10ml中配成0.14mol／L溶液。用4mol／L氢氧化钠溶液调pH至9.0，现用现配。
⑵ 取离心洗涤后的SRBC，按压积1∶4的比例加入0.14mol／L AET溶液，充分混匀。37℃孵育15min，每5min摇匀一次。
⑶ 用PBS或Hanks液洗SRBC 5次，用RPMI 1640培养液配成1%(V／V)细胞悬液。
⑷ 取2～3×106／ml淋巴细胞悬液与等体积的经1%AET处理的绵羊红细胞悬液混合，37℃孵育15～20min，每5min摇匀一次。低速离心(500rpm，5min)，4℃孵育40～45min。将该细胞悬液预温至20℃，叠加于淋巴细胞分离液上作密度梯度离心分离，1500～2000rpm，20min 。余后步骤同神经氨酸酶处理的SRBC分离T细胞法的最后步骤。
【结果】
沉淀于管底的E花环形成细胞即为T细胞群体，用低渗的Tris-氯化胺溶液溶解绵羊红细胞，即可获得较纯的T细胞。
【注意事项】
1．约l0%～80%的NK细胞也能表达CD2分子，故用此法分离的T淋巴细胞难免混杂NK细胞。必要时可用Percoll非连续性密度梯度离心法将T细胞与NK细胞加以分离。
2．AET处理的绵羊红细胞悬液4℃可存放一周，但绵羊红细胞悬液有溶血者不宜使用。
3．小牛血清(RPMI 1640培养液中)用绵羊红细胞吸收后使用，可除去小牛血清中的凝集素，从而提高T细胞的分离率。
【思考题】
1．用E花结分离法分离T细胞的原理是什么？E花结形成细胞均为T细胞吗？为什么？
2．试验中使用的神经氨酸酶和AET的作用是什么？
实验二 E花环形成试验
【原理】
人类T细胞膜表面有E受体—绵羊红细胞(SRBC)受体，在体外一定条件下，当T细胞与SRBC混合并紧密接触时，可形成以T细胞为中心、四周环绕绵羊红细胞的玫瑰花样花环，光学显微镜下可见，简称E花环(E为红细胞erythrocyte的缩写)。根据E花环形成细胞的多少，即可测知外周血中T细胞的总数，即Et(t为total的缩写)。其中有一部分T细胞的E受体对SRBC有较高的亲和力，经低速离心后，即可与SRBC形成花环，此类T细胞称为活性玫瑰花环形成细胞，即Ea(a为active的缩写)。Ea能反映T细胞的体内功能活性，用以表示机体细胞免疫功能和动态变化；Et则代表被检外周血中T细胞的总数和百分率，一般不反映机体的细胞免疫功能。
【材料】
1．淋巴细胞(即PBMC)悬液 用含20%小牛血清的Hanks液(无Ca2+、Mg2+)将细胞浓度调成2.5×106／ml。制备方法见淋巴细胞分离技术。
2．Hanks液 不含Ca2+、Mg2+。
3．绵羊红细胞(SRBC)悬液。
4．8%戊二醛溶液(用Hanks液稀释)。
5．HE染色液（配制见附录)。
6．水平离心机、水浴箱、冰箱、显微镜、血球计数板等。
【方法】
1．Et花环试验
⑴ 分离人外周血单个核细胞，计数后配成2.5×106／ml浓度。
⑵ 取保存于Alsever液中的SRBC(或适量新鲜配制的SRBC) 5ml，用Hanks液洗涤3次后，取少量经适当(约200倍)稀释后滴于血球计数板内，镜下计数，配成1.8×108／ml浓度。
⑶ 取0.1ml淋巴细胞悬液(2.5×106细胞／ml)和0.1ml SRBC悬液(1.8×108／m1)，加于1支圆底小试管内，充分混匀后，置37℃水浴10min。
⑷ 取出后，在水平离心机内离心500rpm，5min，静置4℃冰箱过夜。
⑸ 用毛细吸管吸弃大部分上清液。将试管放在手心轻轻搓动，悬起细胞，加1滴0.8%戊二醛液，轻轻混匀，室温下静置5min以固定细胞。
⑹ 将细胞悬液倾于载玻片上，轻轻涂布使面积约为1～2cm2。于室温或37℃温箱使涂片干燥，HE染色（方法见附录)，镜检(或在第5步后，在试管内加1%美蓝1～2滴，室温下染色3～5min，取1滴细胞悬液于玻片上，加盖玻片后在高倍镜下计数)。
⑺ 淋巴细胞周围凡有3个以上绵羊红细胞紧密附着者，即为Et花环形成细胞。于油镜下计数200个淋巴细胞中的花环形成细胞数，计算出Et花环形成的百分率。
2．Ea花环试验
⑴ 将Et花环试验用的SRBC稀释3倍，使成6×107／ml。
⑵ 于圆底小试管内加入0.1ml待检的淋巴细胞悬液(2.5×106细胞／ml)和0.1ml SRBC(6×107／ml)，混合后，立即于水平离心机离心500rpm，5min。
⑶ 弃去大部分上清液，轻轻悬起细胞，加1滴0.8%戊二醛液固定，静置5min。
⑷ 其余操作同Et花环试验中的(6)、(7)项。计数Ea花环百分率。
【结果】
形成花环细胞数
E花环形成率(%)=×100%
形成花环细胞数 + 未形成花环细胞数
淋巴细胞周围凡有3个以上绵羊红细胞紧密附着者，即为E花环形成细胞。健康人外周血Et花环百分率约为60%～70%，Ea花环百分率约为20%～30%。
【注意事项】
1．SRBC最好用新鲜的，一般采血后保存于Alsever液中，2周内可用。超过2周，与淋巴细胞结合能力下降。
2．从采血到测定不要超过4h，分离的淋巴细胞放置时间也不要超过3～4h，否则SRBC受体会自行脱落。可用台酚兰检查淋巴细胞活力，活细胞数应不少于95%。
3．计数E花环前，应将沉于管底的细胞予以重悬，但只宜轻缓旋转试管，使细胞团块松开即可，不能强力吹打，以免花环解离。
4．整个操作过程的室温以16～23℃较好，过高或过低会使E花环形成率降低。
5．配制PBMC悬液应用10%～20%小牛血清为好。不加小牛血清，E花环形成率降低。
6．SRBC与PBMC的比例，一般以100∶1为宜。
【思考题】
1．Et花环试验与Ea花环试验的操作步骤有什么不同？二者的临床意义有何不同？
2．为什么PBMC与SRBC混合后要进行离心沉淀？重悬细胞时为什么只能轻缓旋转试管，而不能用力摇匀细胞悬液？
3．E花环形成的原理是什么？是否只有T细胞能形成E花环？
实验三 淋巴细胞转化试验
T细胞在体外培养时，受到特异性抗原或促有丝分裂素，如植物血凝素(PHA)或刀豆素A(ConA)刺激后，细胞内核酸和蛋白质合成增加，同时细胞形态转化为母细胞，即为淋巴细胞转化现象。根据淋巴细胞转化率的高低，可以了解机体的细胞免疫水平，常作为检测机体细胞免疫功能的指标之一。试验方法可采用形态学计数法、3H一胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)掺入法等。
一、形态学计数法
【原理】
T淋巴细胞表面有植物血凝素(PHA)受体，T细胞在体外培养时，当受到非特异性的促有丝分裂素PHA刺激后，进行有丝分裂，可转化为淋巴母细胞，细胞的形态和结构发生明显的改变，通过染色镜检，即可计算出淋巴细胞的转化率。
【材料】
1．肝素抗凝的新鲜血液标本。
2．1%粗制PHA(PHA—M)，无菌生理盐水配制(所选用的PHA，最好先测定最适浓度)。
3．细胞营养液 含20%小牛血清的RPMI 1640，每毫升营养液含青、链霉素各200单位(小牛血清要经56℃30min灭活)。
4．0.87%NH4Cl溶液。
5．瑞氏染液(或姬姆萨染液)。
6．水平离心机、培养小瓶、吸管、显微镜等。
【方法】
1．细胞培养 取培养小瓶按下列顺序加入样品和试剂
⑴ 3ml细胞营养液。
⑵ 1ml肝素抗凝全血。
⑶ 实验瓶内加0.2m1 PHA(对照瓶内不加PHA)。
⑷ 混匀后将小瓶以30～45度的角度放入37℃温箱培养72h。
2．制片
⑴ 吸弃瓶内上清液。
⑵ 取0.87%NH4Cl溶液3ml左右(一般为血球体积的5倍)，加入瓶内充分混匀，置37℃15min以破坏红细胞。
⑶ 瓶内细胞悬液移至离心管内，加适量生理盐水混匀后，1000rpm，10min，洗涤两次。
⑷ 吸弃上清，将混匀后细胞沉淀物取样推片，待干燥后作瑞氏染色（染色液配制见附录)。
3．镜下计数
分别取推片头、中、尾三段，计数200个淋巴细胞，包括转化和未转化的淋巴细胞。以下三种均可作为转化的淋巴细胞（见表3-2)：
⑴ 淋巴母细胞 体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍。核膜清晰、核染色质疏松呈细网状。核内见明显核仁1～4个。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突起，胞浆内有时可见小空泡。
⑵ 过渡型淋巴细胞 具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。比静止淋巴细胞大。
⑶ 核分裂细胞 核呈有丝分裂，可见许多成堆或散在的染色体。
【结果】
据上述形态学指标，计算出淋巴细胞转化的百分率
转化的淋巴细胞数
淋巴细胞转化率(%) = ×100%
转化和未转化的淋巴细胞总数
淋巴细胞转化率能反映细胞免疫功能，正常值为60%～80%。
【注意事项】
1．形态学计数法不需特殊设备，没有放射性污染，一般实验室均可采用。但判定结果受主观因素影响较大，重现性较差，测定效率低，已逐渐被同位素掺入等方法所取代。
2．培养瓶的玻璃质量可影响转化率，可选用中性玻璃小瓶(如链霉素或胰岛素瓶)；培养瓶应有足够的空间，一般10ml小瓶加2ml培养基较好。
表3-2 淋巴细胞转化的形态学特征
细胞大小 6～9μm 12～16μm 12～20μm
核大小 核较小、嗜碱性强 核增大、嗜碱性减弱 核大、嗜碱性减弱
染色质致密 疏松疏松可呈网状
核仁 无 有或无 清晰，1～3个
胞浆 极少增多，嗜碱性 增多，嗜碱性
浆内空泡 无 有或无 有或无
【思考题】
1．是否可用特异性抗原作为刺激剂进行淋巴细胞转化试验？如果可以，其机制是什么？转化率与用非特异性有丝分裂素作为刺激剂比较，哪个转化率高？为什么？
2．除了PHA外，还可用其它非特异性有丝分裂素进行淋巴细胞转化试验吗？
二、3H—胸腺嘧啶(3H—TdR)掺入法
【原理】
T淋巴细胞受特异性抗原或PHA刺激后，在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA合成明显增加。细胞转化程度愈高，DNA合成也愈多。此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素3H(氚)标记，加入到培养系统中，即可被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内，培养终止后，测定淋巴细胞内掺入的3H—TdR的放射量，即能判定淋巴细胞的转化程度。此法较形态学计数法客观、准确，重复性也好，但需一定设备条件。
【材料】
l．肝素抗凝的新鲜血液标本。
2．植物血凝素(PHA，1mg／ml)。
3．细胞营养液（配制方法见附录)。
4．3H—TdR 100微居里／ml。
5．蒸馏水、5%三氯醋酸、无水乙醇。
6．玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置。
7．闪烁液（配制方法见附录)及液体闪烁计数仪等。
【方法】
（一)微量全血法
1．每份血标本用6个培养瓶，分别加入2ml细胞营养液和0.2ml肝素抗凝新鲜血液。
2．在第1～3瓶内各加PHA 0.1ml(最终浓度为25～50微克／毫升)。第4～6瓶不加PHA作为细胞对照。
3．放37℃恒温箱内培养3d。终止培养前12～18h，每瓶内加入3H—TdR 1微居里／10微升，继续培养。
4．终止培养后，每瓶内加入蒸馏水5毫升，溶解红细胞。分别吸出各瓶材料置玻璃纤维滤膜上，经负压抽滤除去未掺入细胞内的游离3H—TdR。再依次用5%三氯醋酸固定，无水乙醇脱色。
5．将玻璃纤维滤膜置60～80℃烘干，顺次放入测量瓶内，加5毫升闪烁液，置液体闪烁计数仪内测量样品的放射性，以每分脉冲数(cpm)表示。
（二)分离淋巴细胞3H—TdR掺入法
此法原理、材料同上。
1．按“外周血淋巴细胞分离技术”分离和制备淋巴细胞悬液，用细胞营养液调整细胞浓度为1×106／ml。
2．试验在96孔微量培养塑料板上进行，每份标本加6孔。3孔为试验孔(3个复孔)，每孔加细胞悬液0.1ml、PHA 20μg／0.1ml。另外3孔为对照孔，每孔加细胞悬液0.lml，营养液0.1ml。
3．置37℃ 5%CO2培养箱56h后，每孔加3H—TdR 1微居里／10μl，继续培养16h。
4．终止培养，用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上。用生理盐水充分洗涤，以洗除游离的3H—TdR。
5．滴加5%三氯醋酸5ml固定细胞，并除去酸溶性小细胞。
6．滴加无水乙醇5ml脱水、脱色。
7．同上法“5”。
【结果】
1．计算刺激组(加PHA刺激)及细胞对照组(未加PHA)3份样品的cpm均值(每一标本作三份复管)。
2．计算刺激指数(stimulating index，SI)作为判断淋巴细胞转化程度的指标。
刺激组(加PHA刺激)cpm均值
刺激指数(SI) =
对照组(未加PHA刺激)cpm均值
【注意事项】
1．PHA在刺激淋巴细胞转化时有一个最适浓度，浓度过高或过低都会降低淋巴细胞的转化率。
2．本试验细胞培养时间较长，故整个试验过程应注意无菌操作，否则因污染会导致实验失败。
3．实验过程中使用的同位素，须严格按照同位素操作规则进行操作，以防污染环境。
4．同位素掺入法的影响因素较多，如细胞浓度、PHA浓度、培养时间、培养液成分及3H—TdR的活性等，故应严格控制实验条件。
【思考题】
1．试比较形态学计数法和3H—TdR掺入法进行淋巴细胞转化试验的优缺点。
2．为什么PHA能刺激人的T细胞转化而不能刺激B细胞转化？
实验四 白细胞移动抑制试验
【原理】
致敏T细胞在体外与相应抗原再次接触或正常人的T细胞受有丝分裂原(如PHA)刺激，可产生多种细胞因子，如巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor，MIF)和白细胞移动抑制因子(leucocyte migrationinhibitory factor，LIF)，可分别抑制巨噬细胞和白细胞的移动。据选择的指示细胞(巨噬细胞或白细胞)不同，可分为巨噬细胞移动抑制试验和白细胞移动抑制试验，以后者较为常用。原因是T细胞与其它白细胞可同时从外周血中获得，二者不需分离，操作简便。根据白细胞的移动受LIF抑制的程度，可判断受检者的细胞免疫功能。
【材料】
1．肝素抗凝血2ml。
2．毛细玻璃管 长70～80mm，内径0.7mm，干烤灭菌。
3．培养小室 用玻璃板(或有机玻璃)制成，内径2cm，高0 .5cm。用前洗净、晾干，置紫外灯下照射1h灭菌。
4．26×26mm灭菌盖玻片。
5．含20%小牛血清的RPMI 1640培养液。
6．PHA原液浓度8mg／ml，使用时用1640培养液配制成1∶100和l∶500两种浓度。(抗原则按实验目的不同而选定，常用1／10或1／100稀释的旧结核菌素)。
7．有盖搪瓷盘、白凡士林、小镊子、砂轮、投影仪及分离淋巴细胞的所需器材。
【方法】
1．采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，计数收获淋巴细胞总数。
2．制备红细胞悬液 使其浓度达109／ml，并用红细胞悬液调节白细胞浓度至5×106／ml(白细胞向毛细管外移动游走时，红细胞因其浓度大而被动地被白细胞带出管外，使结果更易观察)。
3．用虹吸法将混合血细胞收入毛细管内，吸入高度约60mm，并将玻管无细胞端用火焰封口，每一标本共制六支毛细管。
4．将毛细管放入垫有少许棉花的试管中(毛细管开口端向上)，于水平式离心机中离心2000rpm，20min。
5．用砂轮于上清液和细胞界面处截断毛细管。
6．用镊子夹取盛有压积细胞的毛细管，将其封闭端用白凡土林少许粘于培养小室内，并使开口端朝向小室中央，每个小室放一支。
7．于两个小室内分别注满含有1/100、l/500PHA的营养液，另用不含PHA的营养液注入另一个小室作为对照。试验组和对照组均设复管。
8．在培养小室边缘涂凡士林少许，加盖坡片封闭小室(注意不要在小室内留有气泡)，将小室放入湿盒，于37℃温箱中培养13～24h后观察结果。
【结果】
1．在投影仪下画出试验组与对照组白细胞移动图象，测得白细胞移动面积，得出各组平均值(图3-2)。
2．计算移动抑制指数(MI)
试验组细胞移动面积均值
移动抑制指数(MI) =
对照组细胞移动面积均值
MI在0.8～1.2之间为正常值，表示机体对该抗原无特异性细胞免疫作用；MI<0.8，为移动抑制试验阳性反应，表示机体对该抗原有特异性细胞免疫作用。
移动抑制试验是检测机体细胞免疫状态的一种体外试验，与皮肤迟发型超敏反应试验相关性较好，可用于肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫性疾病和传染性疾病等的研究。
对照组（不加PHA) 实验组（加PHA)
图3-2 白细胞移动抑制试验示意图
【注意事项】
1．毛细管内径、管壁厚薄要尽量一致。
2．水平离心后，白细胞不宜放置过久，在空气中暴露时间不宜过长。
3．各管的细胞悬液高度要尽量一致。
【思考题】
1．T淋巴细胞在什么情况下产生LIF?检测LIF有何实际意义?
2．致敏T细胞在特异性抗原刺激下还可产生哪些重要的细胞因子？
实验五 白细胞介素2的诱生与活性测定
一、白细胞介素2(IL-2)的诱生方法
1．常规分离PBMC，用含10%FCS RPMI 1640液调整细胞浓度至1×106／ml。
2．细胞悬液加入24孔培养板，1ml／孔，加入PHA 125μg／孔，37℃CO2培养箱培养48h。
3．离心2000rpm，20min，收集上清液，-20℃冻存待检。
二、IL-2的活性测定
（一)3H—TdR掺入法
【原理】
白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)由活化Th细胞产生，是T细胞进行克隆扩增以及维持T细胞在体外生长所必需的一种重要的细胞因子。检测IL-2活性的原理是：由于T淋巴细胞在体外必须有IL-2才能生长，故可选用对IL-2呈依赖性的T淋巴细胞株(如CTLL-2)进行检测。在CTLL-2培养过程中，加入待测标本(如用PHA刺激的PBMC培养上清液)，如果CTLL-2得以生长，表明待测标本中含IL-2。且CTLL-2对IL-2的需求，在一定范围内呈剂量依赖性，因此，可以根椐CTLL-2细胞生长的程度，对IL一2活性定量测定。
CTLL-2(cytotoxic T-lymphocyte line 2)是来源于C57BL／6小鼠的细胞毒T细胞系，对IL-2有依赖的特性，即只能在有IL-2存在的培养基中才能生长，因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL一2的水平。除CTLL-2外，丝裂原活化的T淋巴母细胞和小鼠胸腺细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。
【材料】
1．检测细胞 CTLL-2(一株小鼠来源的IL一2依赖细胞株)。
2．待测IL一2样品 用PHA刺激的PBMC培养上清液。
3．已知活性为100u／ml的IL一2标准品，10%FCS RPMI1640。
4．浓度为1mci／ml的3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)。
5．微量细胞收集仪、液体闪烁计数器。
6．PP0(2,5-二苯基恶唑，2,5-diphenyloxazole)、POPOP[1,4双(2’-c5’苯基恶唑)苯，1,4-di-(2’-c5’-phenyloxazolyl)-benzene]、二甲苯。
【方法】
1．制备CTLL-2细胞悬液 收集生长良好的CTLL-2细胞，1500rpm，5min，用10%FCS RPMI1640洗涤细胞两次，制成细胞悬液。取一滴用0.5%台酚蓝染色检测细胞活力(应在95%以上)。调整细胞浓度至1×l05／ml。
2．加样 将标准品和待测样品分别作倍比稀释。按每孔100μl加入96孔平底培养板中，每个稀释度各加3个复孔。然后，每孔加入CTLL-2细胞悬液l00μl。另设3个对照孔，只加100μl细胞和100μl培养液，不加IL-2。加样后，培养板置37℃5%CO2培养箱中孵育24h。
3．同位素的掺入及计数 在培养终止前6～10h加入同位素，每孔加入lμci 3HTdR。培养结束后立即用微量细胞收集仪收集细胞。液体闪烁计数测定每管的cpm值。
【结果】
待测样品cpm最大值50%所需稀释度
IL-2活性(u／ml)= ×标准品活性
标准品cpm最大值50%所需稀释度
3HTdR掺入法测得各孔cpm值后，可计算IL-2的活性单位。首先计算出细胞增殖强度R(R为IL-2孔的cpm值)，不同IL-2稀释度时的R值不同。以IL-2稀释度为横坐标，R值为纵坐标，绘制出两者的关系曲线，由曲线查得最大R值。然后找出50%最大R值相应的IL-2稀释度，称为1个IL-2活性单位。
例如：IL-2检测样品的一个活性单位为1∶32，则此样品中含IL-2的浓度为32u/ml。若与已知单位的IL-2标准品比较，即可计算出样品的标准单位。假设IL-2标准品为50μg/ml，在本次试验测得50%最大R值为1∶40；待测样品的50%最大R值为1∶32，则其IL-2的标准单位数(N)可由下式计算：
N = 50μg/ml ×(32/40)
【注意事项】
1．CTLL-2在体外长期维持培养比较困难，若条件不具备，可改用ConA激活小鼠胸腺细胞作为检测细胞，方法类似。
2．待测IL-2粗样品中常含低分子量的抑制因子，可经透析后再检测，以提高结果的准确性。
3．检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞，目的是除去残留的IL-2，以免干扰检测结果。但操作必须轻柔，离心速度不宜过高。
4．加入3HTdR的最适时机是阴性对照细胞趋于全部死亡。
5．CTLL-2细胞冻存后复苏较困难，用含丝裂原的培养基长期培养易发生变异。
6．避免同位素污染。
7．加入标准IL-2或待检样品时，按从低浓度到高浓度顺序加入。
【思考题】
1．IL-2主要由何种细胞产生?检测IL-2的活性有何实际意义?
2．为什么说CTLL-2细胞在体外长期维持培养比较困难？
3．简要说明IL-2的诱生过程及其主要生物学作用。
（二)MTT比色法
【原理】
白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由Th细胞产生的一种细胞因子，在淋巴细胞增殖分化过程中起着非常重要的作用，而且能维持T细胞在体外长期生长。MTT比色法的原理是以DNA合成酶活性为指标，检测IL-2的活性。CTLL-2是一株IL-2依赖性T淋巴细胞株，只有在IL-2存在的条件下，CTLL-2才能增殖、分裂。细胞增殖活跃时线粒体中琥珀酸脱氢酶活性增加，该酶能使黄色的MTT氧化后形成蓝色结晶状颗粒(formazan)，蓝色颗粒formazan的量与IL-2活性水平成正比，通过比色法进行定量。
MTT比色法具有简单，快速，敏感的特点，在掌握良好的试验条件下，其敏感性可接近3HTdR掺入法，且不需要接触同位素。
【材料】
1．PRMI 1640细胞培养液 内含2mol／L谷氨酰胺，25mol／L HEPES，青霉素100u／m1，链霉素100u／ml及10%灭活小牛血清。
2．PBS-G 含0.5%葡萄糖的磷酸缓冲液(PBS)0.02mol／L，pH7.2。
3．MTT 3-[4,5-Dimethythiajol一2yl]一2,5一diphenyltetrajolium bronide，中文名为3-(4’,5’-二甲噻唑-乙基)-2,4-二苯四唑嗅盐，用PBS-G配成1mg／ml使用液，4℃避光。
4．DMSO(二甲基亚砜)。
5．IL-2标准品 活性为500u／m1。
6．CTLL-2 一株来源于小鼠的IL一2依赖细胞株。
【方法】
1．制备CTLL一2细胞悬液 收集生长良好的CTLL-2细胞，用RPMI 1640细胞培养液洗涤细胞两次，1500rpm，5min。然后制成细胞悬液，用0.5%台酚蓝液染色检测细胞存活率(应在95%以上)，调整细胞浓度至1×105／ml。
2．加样 将标准品及待测样品作倍比稀释，按每孔100μl加入96孔平底细胞培养板中，每个稀释度三个复孔。然后，每孔加CTLL-2细胞悬液100μl。另设三个对照孔，只加100μl细胞和100μl培养液，37℃5%CO2条件下培养32～40h。轻轻吸弃上清液l00μl，加入MTT溶液(1mg／ml)50μl。于振荡器上振荡1min，放置37℃、5%CO2孵育箱内反应2h。取出培养板，2000rpm，5min，吸弃上清液，每孔加入DMS0 120μl，振荡30s后，在酶标仪540nm处读取OD值。
【结果】
待测样品OD值最大值的50%所需稀释度
IL-2活性(u／ml) = ×标准品活性
标准品OD值最大值的50%所需稀释度
【注意事项】
1．检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞，目的是除去残留的IL-2，以免干扰检测结果。但操作必须轻柔，离心速度不宜过高。
2．具体计算方法可参照3HTdR掺入法的结果计算举例。
【思考题】
1．试述MTT比色法和3HTdR掺入法检测IL-2活性的优缺点。
2．MTT比色法检测IL-2活性的原理是什么？可否把MTT比色法用于淋巴细胞转化试验？
3．检测IL-2的生物活性与采用ELISA法检测血清中IL-2水平的临床意义有何不同？
实验六 CTL杀伤功能测定——51Cr释放法
【原理】
细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)对靶细胞的杀伤作用具有特异性，即由某种抗原致敏的CTL，只对带有相同抗原的靶细胞产生杀伤作用。如单向MLR诱导产生的CTL，在杀伤靶细胞时 ，必须识别相应的同种异型抗原，并受到MHC的限制。CTL的杀伤功能常采用51Cr释放试验进行检测，当用同位素铬酸钠(Na251CrO4)标记靶细胞时，铬酸盐离子(51CrO42-)以渗透方式进入细胞浆并与细胞浆内蛋白质结合。当这种细胞被效应细胞杀伤后，胞浆内51Cr从细胞膜损伤或裂解处释放出来，测定所释放的同位素量可反映CTL杀伤作用的强度。
【材料】
1．动物 不同H-2的近交系小鼠。
2．靶细胞 已知H-2的瘤株，如P815(H-2d)。
3．试剂 Na251CrO4溶液，比活性250～500mci／mmol，浓度l mci／ml(英国Amersham)或28mci／ml(北京原子能所)。2.5%Triton X-100、0 .5%台酚蓝染液、丝裂霉素C、Tris-氯化铵溶液(溶解小鼠脾细胞中夹杂的红细胞)。完全培养液(CM)、BSS／10(含10%小牛血清的平衡盐溶液)。
4．器材 培养瓶、玻璃滴管、离心管、试管架、血球计数板、定量加样器及加样塑料头、青霉素瓶、96孔微量细胞培养板(圆底或平底)。倒置及光学显徽镜、水平式离心机及盛放96孔培养板的离心用吊蓝、γ计数仪(瑞典LKB公司)、CO2培养箱。
【方法】
1．效应细胞的制备
用单向混合淋巴细胞培养诱导产生CTL。按常规方法制备反应细胞(除去红细胞的甲小鼠脾细胞)。刺激细胞按下面步骤制备：选择H-2与甲鼠不同的乙品系小鼠，制备除去红细胞的脾细胞悬液，置于25m1培养方瓶内，平卧接受60钴2.000rad γ射线照射。以CM洗涤一次后，调整细胞至所需浓度；或用25μg丝裂霉素C／l×107脾细胞／ml浓度处理，经37℃、水浴30min后，依次用BSS／10洗涤二次和CM洗涤一次后，调整细胞至所需浓度。用台酚蓝染色检测细胞活力，要求活细胞>90%。
将2×107反应细胞(甲小鼠脾细胞)与2×107刺激细胞(γ射线照射或丝裂霉素C处理的乙小鼠脾细胞)混于20ml CM中，加入体积为50ml培养方瓶内(底面积2×4cm2，液面高3cm)。轻轻旋上瓶盖，并设单纯反应细胞或刺激细胞的对照瓶。在37℃、饱和湿度、5%CO2条件的培养箱内培养4d或5d。
2．靶细胞的制备 医.学全在线
若在MLC中诱导的是H-2d抗原特异性的CTL，可采用DBA／2小鼠肥大细胞瘤株P815(H-2d)为靶细胞。同位素标记靶细胞的方法是先常规培养P815细胞，实验前一天换上新鲜培养液，实验当天检测细胞活力需大于95%。然后，取2×106／0.5ml P815细胞加入100μci Na251Cr04，37℃水浴2h，结束后洗涤3次，调整细胞浓度至l×105／ml。
3．细胞毒试验
收集效应细胞入离心管内，取离心后细胞沉淀部分，用CM调节活细胞浓度至l.0×107／m1，并可根据不同效靶比例要求，对倍稀释成5×106／ml、2．5×106／ml、1.25×106／ml细胞悬液。然后在96孔板中加入1×104／0.1ml的标记细胞，实验孔加入不同比例的效应细胞0.1ml，自然释放孔加入0.1ml CM，最大释放孔加入0.lml 2.5%TritonX-100，每组3～4个复孔。再经500rpm，30s离心，使效、靶细胞接触，然后置CO2培养箱内温育4～6h，最后经1000～1500rpm，5～10min离心沉淀，依次吸出每孔中上清液0.1ml置于小塑料管内盖紧，在γ计数仪上进行测定。
【结果】
分别计算实验组、自然释放组及最大释放组cpm，按下列公式进行计算
实验组cpm – 自然释放组cpm
51Cr特异性释放率 = ×100
最大释放组cpm – 自然释放组cpm
四小时自然释放率>10%～15%
最大释放率通常>90%
特异性释放率随效／靶比例6.25∶l、12.5∶1、25∶l、50∶1和100∶l而递增，两者间常呈相关性。由于CTL特异性杀伤力强，一般采用的效／靶比例为50∶1。
【注意事项】
1．细胞活力大小是实验成败的关键，故操作时动作要迅速。培养过程使pH恒定在7.2～7.4之间。
2．靶细胞处于对数生长期标记率高。为此，实验前一天务必换液，确保细胞生长良好。在靶细胞标记过程中，由于51Cr进入靶细胞浆内，细胞脆性增大，因此震荡动作要轻揉。
3．51Cr自然释放率常随效靶细胞作用时间延长而偏高，如作用时间为18h，自然释放率可高于20%，故宜做短程试验；51Cr半衰期短，存放时间最好不要超过2个半衰期，否则标记率低，自然释放率高。
4．国产51Cr比活性低，欲达到要求的放射强度，务必加大51Cr用量，这就不可避免地增加了铬含量，造成对靶细胞损伤，致4h自然释放率往往超过允许范围(>15%)。此时只能中止实验。
5．经单向MLR后，培养物中包含不少死细胞，有条件可采用20%Metrizamide分离去之。
【思考题】
1．CTL杀伤靶细胞的机制是什么？与补体的溶细胞机制有何区别？
2．怎样理解CTL杀伤靶细胞时的抗原特异性和MHC限制性？
3．如欲检查某种肿瘤抗原或免疫原性治疗药物与CTL杀伤功能的关系，怎样设计试验？
