第五章  分子荧光分析法

第一节 概述

物质分子吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，激发态分子以辐射的形式释放能量回到基态，根据这一现象建立的分析方法称为发光分析法。外界提供能量的方式有多种，若物质吸收光能后的激发态以电磁辐射形式释放能量回到基态，称为光致发光。常见的光致发光有荧光（fluorescence)和磷光（phosphorescence)两种。根据研究对象的不同，荧光可分为原子荧光和分子荧光。根据物质的分子吸收光能后发射出荧光光谱的特征和强度对物质进行定性和定量的分析方法称为分子荧光分析法（molecularfluorescence analysis)。荧光的波长范围比较广，可从X光到红外光区。本章重点介绍紫外、可见光区域的分子荧光。

荧光分析法不仅能直接测定荧光物质，也能通过衍生反应测定非荧光物质。荧光分析法灵敏度高，其检测限可达10^-10~10^-12g/ml，灵敏度比紫外可见光谱法高2～4个数量级，且选择性好，能提供诸多分析信息。已成为重要的痕量分析手段，广泛应用于生命科学、医药卫生、环境科学等领域。

 第二节 基本原理

一、分子荧光的发生过程

物质分子中存在着电子能级、振动能级和转动能级。在室温时，大多数分子处于电子基态的最低振动能级（基态)。当分子吸收能量（电能、光能、热能或化学能等)后，就会发生能级之间的跃迁。可跃迁到激发态。分子在激发态是不稳定的，它很快跃迁回到基态。

在基态分子中，电子按能量最低原则成对地排列于一定的轨道中。根据泡利（Pauli)不相容原理，分子内同一轨道中的两个电子必须具有相反的旋转方向，即自旋量子数S分别为1/2和-1/2，总自旋量子数（的代数和)S_总 =0，其分子态的多重性M=2S+1=1，该分子就处在单重态（见图5—1a)。倘若分子吸收能量后在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，则分子处于激发单重态（见图5—1b)。如果在跃迁到高能级的过程中伴随着电子自旋方向的改变，这时，分子便具有两个不配对的电子，则有S_总=1，M=2S+1=3，该分子处在激发三重态（见图5—1c)，用符号T表示。处在分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级要低。

图5-1  单重态和三重态

当分子吸收光能量后，处于基态最低振动能级的分子跃迁到第一电子激发态以至更高激发态的各个不同的振动能级(这一过程速度很快，大约10^-15s)，成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过辐射跃迁或无辐射跃迁释放出能量返回基态，这一过程称为去激发过程。

分子吸收光能量后去激发的光物理过程见图5—2。

图5-2荧光和磷光产生示意图

图中S₀，S₁，S₂分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态，T₁表示第一激发三重态。激发态分子去激发过程中的几种能量传递的方式有：①振动弛豫：激发态（如S₁和S₂)的分子通过与溶剂分子的碰撞，把多余的振动能量极迅速地（约为10^-12s)传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级。②内部转换：当S₁的较低振动能级和S₂较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S₂的振动能级以无辐射方式过渡到S₁的振动能量相等的振动能级上，内部转换发生的时间为10^-12s。③荧光发射：处于第一电子激发态的最低振动能级的分子仍不稳定，再以辐射形式发射光量子而返回基态的任意振动能级，这时发射的光量子称为荧光。荧光发射过程约为10^-7~10^-9s左右。由于振动驰豫和内部转换使激发态分子失去部分能量，因此荧光的波长总比激发光波长要长。④外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质分子间相互作用，并以热的形式损失部分能量的过程称为外部转换。外部转换使荧光强度减弱或消失，导致荧光猝灭。⑤体系间跨越：在激发和去激发过程中，通常电子的旋转状态保持不变，但在某些状态下，单重态通过体系间跨越，激发态电子改变其自旋方向出现三重态。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的概率增大。⑥磷光发射：激发态分子经体系间跨越到达激发三重态后，并经过振动驰豫到达三重态的最低振动能级，再回到基态各个振动能级的过程中发射出磷光。磷光发射涉及到电子自旋状态的改变，属于“禁阻跃迁”，其寿命比荧光要长，约为10^-3~10 s，所以，将激发光从磷光样品移走后，常常还可以观察到后发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。

二、激发光谱和荧光光谱

所有荧光化合物，都具有两种特征光谱，即荧光激发光谱与荧光发射光谱。

(一) 荧光激发光谱 荧光激发光谱（excitation spectrum)简称激发光谱。固定荧光波长，改变激发光波长，测定不同波长的激发光激发所得到的荧光强度，然后以激发光波长为横坐标，荧光强度F为纵坐标作图，即为该荧光物质的激发光谱(如图5-3虚线部分)。激发光谱相当于荧光物质的吸收光谱，此光谱上荧光强度最大所对应的波长，就是激发荧光最灵敏的波长。

（二)荧光发射光谱  荧光发射光谱  (fluorescencespectrum)简称荧光光谱。固定激发波长在物质的激发荧光最灵敏的波长，测定不同荧光波长时的荧光强度F，以荧光波长为横坐标，荧光强度F为纵坐标作图，即为荧光发射光谱， (如图5-3实线部分)。此光谱上荧光强度最大的波长称为最大荧光波长。

图5-3蒽的激发光谱和荧光光谱(环己烷作溶剂)

（三)三维荧光光谱 三维荧光光谱(Three dimensionalfluorescent spectroscopy )， 也称总发光光谱、等高线光谱等。三维荧光光谱是20世纪 80年代发展起来的一种新的荧光分析技术，主要是能获得激发波长与发射波长同时变化的荧光强度光谱图。三维荧光光谱可用两种形式表示： （1)三维曲线光谱图；（2)平面显示的等强度线光谱图, 如图5-4(a)和(b)所示。三维荧光光谱技术能够获得完整的荧光光谱的信息，是一种很有价值的光谱指纹技术。可以进行多组分混合物的定性、定量分析。

图5-4 三维荧光光谱图

（四)荧光光谱的特征

1．荧光光谱与激发光波长无关：从荧光发生过程可知，处于不同激发态分子的荧光发射，电子最终都是从第一电子激发态的最低振动能级开始，直接发射荧光而回到基态的各个振动能级上，所以荧光光谱与激发光波长无关。

2．荧光波长比激发光波长较长  这是由于激发光以无辐射跃迁失掉一部分能量到达第一电子激发态最低振动能级，再发射荧光，因此荧光发射能量比激发能量低，故荧光波长比激发光谱的波长较长。这种现象称为Stokes位移，又称红移。

3．激发光谱与荧光光谱呈现镜像对称关系  以蒽乙醇溶液为例，激发光谱中的小峰是蒽分子吸收能量后从基态跃迁到激发态的各个不同的振动能级所造成的。而发射光谱中的小峰是由于蒽分子从第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态的各个不同振动能级，发射不同的光量子所产生。大多数分子的基态振动能级分布和第一电子激发态振动能级分布相似，因此，激发光谱中跃迁能量最小的和最大的波长分别和荧光光谱中发射能量最大的和最小的相对应，使激发光谱与荧光光谱相对称并呈现镜像关系。

（五)激发光谱与荧光光谱的应用

1．定性分析  将荧光物质的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准物质的光谱图进行比较，即可进行定性分析。由于有激发和发射两个谱图可供参考，所以荧光光谱法定性的可靠性较紫外可见吸收光谱法高。

2．定量分析 根据荧光光谱图中最大激发波长λ_ex和最大荧光波长λ_em，可以得到定量分析的最佳光谱条件

三、荧光与物质的分子结构

荧光的发生涉及分子吸收辐射和激发态分子发射辐射两个过程，因此，能夠发荧光的物质必须同时具备两个条件，一是物质分子必须具有強的吸收紫外-可兄辐射的征结构；二是必须具有较高的的荧光效率。

（一)荧光发射的量子产率

物质发射荧光的光子数和所吸收的激发光光子数的比值称为荧光量子产率(fluorescence quantumyield)，或称荧光效率 (fluorescence efficiency)，用  表示：

可见的极大值为1，但事实上大部分荧光物质的值均小于1并在1和0之间。许多能吸收光能量的物质不一定会发出荧光，因为在激发态分子释放激发能过程中除荧光发射外，有无辐射跃迁过程与之竞争。因此，荧光效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关，即：

  （5-1)

式中，为荧光发射过程的速率常数；无辐射跃迁过程的速率常数总和。主要取决于分子的化学结构，而与荧光物质分子所处的化学环境有关，降低有利于体系的荧光增强。

（二)分子结构与荧光

由于荧光物质结构的特殊性所致，在已知的大量有机物和无机物中，只有小部分可以产生荧光。荧光物质的分子结构应具备如下特征：

1．共轭π键结构 绝大多数能产生荧光的物质含有芳香环或杂环。因为这些分子具有共轭p键结构，易发生π—π^*跃迁，分子体系共轭程度愈大，荧光效率愈高（表5-1)。另外含有共轭双键的脂肪烃也可产生荧光，如维生素A，但这类化合物很少。

表5-1  三个化合物的共轭结构与荧光效率的关系

2．刚性平面结构  具有刚性平面构型的分子有利于荧光发射， 由于这种刚性平面构型降低了分子的振动，减少了分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用，提高了分子的荧光效率。例如荧光素呈平面构型，是强荧光物质，它在0.1mol/L NaOH溶液中的荧光效率为0.92，而与其结构相似的酚酞由于没有氧桥，分子不易保持平面，所以分子不发光，不是荧光物质。

3. 取代基团对分子荧光的影响  在芳香族化合物的芳香环上取代基不同，对荧光物质的荧光光谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基，如：-NH₂、-OH、-OCH₃、-CN等，能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高；而吸电子基团，如：-COOH、-NO₂、-C＝O、-F、-C1等，可减弱分子π电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。

四、荧光强度与溶液浓度的关系

分子荧光分析法是测定物质吸收一定光能被激发之后，物质本身所发射的荧光强度（F)。因此，被测溶液的荧光强度与该溶液吸收光能的强度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。当强度为I₀的入射光激发荧光物质溶液后，可以从溶液的各个方向观察到荧光，但激发光的一部分可透过溶液，为了消除透射光的影响，一般是在与激发光源垂直的方向观测。如图5-5所示

图5-5  溶液的荧光

假设强度为I₀的入射光，照射到浓度为c，液层厚度为b的荧光物质溶液上，透射光强度为I，被溶液吸收光强度为I₀ -I，溶液的荧光效率为，荧光强度为F。根据光吸收定律

  （5-2)

则     

（5-3)

由于溶液的荧光强度F与被溶液吸收的光强度及荧光效率成正比

则      

 （5-4)

式中k为比例常数

因  

  （5-5)

则 

    （5-6)

如果浓度c很小，当时，中括号内第二项以后的数值可以忽略不计，上式可写成

（5-7)

对一定的荧光物质，当测定条件固定时，则

   （5-8)

对某一物质的稀溶液()，在一定的条件下，物质发出的荧光强度与该溶液的浓度成正比。即为分子荧光分析法的定量依据。

五、影响荧光强度的外部因素

（一) 溶剂的影响  

在不同的溶剂中，同一种荧光物质，其荧光光谱的位置和荧光强度都有一定差异。溶剂的影响主要与溶剂的极性、粘度、纯度有关。

1．荧光强度在一定范围内可随溶剂粘度的减小而减小。因为溶剂粘度减小时增加了分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加，造成能量损失，荧光强度减弱。

2．溶剂和荧光物质形成化合物，溶剂使荧光物质的电离状态改变，使荧光峰的波长和荧光强度发生变化。如在萘胺的乙醇溶液中加入盐酸，随着溶液中盐酸浓度的增加，萘胺的—NH₂基逐渐被—NH₃Cl基所代替，而—NH₃Cl基对萘环的特征频率的影响小于—NH₂，因此溶液的荧光光谱趋近于萘的荧光光谱。

3．荧光波长随溶剂极性增大而红移。许多共轭芳香族化合物激发时产生π—π^*跃迁，其激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂极性的增大，激发态能量的降低程度比基态大，结果使荧光光谱随溶剂的极性增大而向长波方向移动。

4．溶剂的纯度要高。杂质会使被测物的荧光增强或减弱，甚至改变荧光光谱的形状，最终干扰样品的测定。如用乙醇作溶剂时，若含有微量蒽，会使溶剂本身产生荧光。特别是当溶剂中存在降低荧光强度的物质时，常常因不易被发觉而引入测定误差。因此在使用前应设法纯化溶剂，消除干扰。

(二) 温度的影响

溶液的荧光强度对温度十分敏感，一般情况下随着温度的升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度减小。其主要原因是温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，增加了分子的无辐射跃迁，降低了荧光效率。另外，有些荧光物质在较高温度下会发生光分解，导致荧光效率降低。降低温度有利于提高荧光效率，因此，低温荧光分析技术已成为荧光分析的一个重要手段。

(三) 酸度的影响

酸度对荧光强度的影响主要表现在下列两个方面：

1．影响荧光物质的存在形式 荧光物质本身是弱酸或弱碱时，在不同酸度条件下分子和离子间的平衡发生改变，造成存在形式不同，而不同的结构型体具有其特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺，分子和离子间的平衡如下

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，—NH₂为提高荧光效率的取代基，此时苯胺可产生蓝色荧光，而pH＜2 和pH＞13的溶液中苯胺为离子形式，无荧光产生。

2．影响荧光配合物的组成 当利用金属离子与有机试剂生成荧光配合物进行测定时，其配合物的稳定性和组成受溶液pH值的影响较大，例如Ga²⁺与2，2-二羟基偶氮苯在pH为3~4的溶液中形成1：1配合物，产生荧光。而在pH6～7的溶液中则形成1：2的配合物，不产生荧光。

可见，荧光物质的荧光光谱、荧光效率及荧光强度随溶液pH值的变化而变化，为提高实验结果的灵敏度和准确度，在实验时要严格控制溶液的pH值。

(四) 荧光猝灭

荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度下降，或荧光强度与溶液浓度不成线性关系的现象称为荧光猝灭。与荧光物质分子发生相互作用引起荧光猝灭的物质称为荧光熄灭剂。常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。引起荧光猝灭的原因有：

1．碰撞猝灭  激发态荧光物质和猝灭剂分子碰撞使能量发生转移。荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。

2．静态猝灭  荧光物质分子与猝灭剂分子作用生成了不发光的配合物。

3．转入三重态的猝灭  荧光物质分子中引入溴、碘或氧后，易发生体系间跨越，医学招聘网由单重态跃迁到三重态，而无荧光发射，引起猝灭。

4．荧光物质的自猝灭  当荧光物质浓度较高时由于荧光分子间碰撞几率增加，以及分子间相互作用形成二聚体或多聚体，产生荧光自猝灭现象。溶液浓度越高，自猝灭现象越严重。

5．内滤作用  当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，也会使体系的荧光减弱，这种现象称为内滤作用。如果荧光物质的荧光光谱与该物质的吸收光谱有重叠，当浓度较大时，部分基态分子将吸收体系发射的荧光，从而使荧光强度降低，这种自吸现象也是一种内滤作用。

荧光猝灭影响荧光测定，这是荧光分析中的不利因素，但是如果一个荧光物质在加入某种猝灭剂后，荧光强度减小的程度和荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，如利用氧分子对硼酸根－二苯乙醇酮配合物的荧光猝灭效应可以进行微量氧的测定。铝—桑色素配合物的荧光强度因微量氟离子的存在而引起荧光猝灭，可用于测定样品中氟离子的含量。利用这一性质建立猝灭剂的荧光测定法，称为荧光猝灭法(fluorescencequenching method)。荧光猝灭法比直接荧光法更灵敏、更有选择性。

(五) 散射光

在荧光分析中，干扰荧光测定的散射光主要有三种。

1．瑞利(Reyleigh)散射  物质分子吸收光能后，不足以引起电子能级的跃迁，而是将分子激发到基态中较高的振动能级，并在极短的时间内回到原来能级，所发射的光称为瑞利散射光。由于它没有能量损失，所以瑞利散射光和激发光的波长相同，且它的强度与波长的四次方成反比，即波长越短，瑞利散射越大。瑞利散射主要是由溶剂和其它共存物质分子产生。

2．拉曼(Raman)散射  由于物质分子吸收了光能后，被激发到基态的较高振动能级以后，返回到稍高于或稍低于原来的能级而发出的光称拉曼散射光。其波长比它的激发光波长稍长或稍短。拉曼散射光较弱，且它的波长随激发光的波长不同而改变。

3．丁铎尔(Tyndall)散射  样品池中如有胶体颗粒或气泡存在时，入射光就会改变方向而进入检测器，这种现象称为丁铎尔散射。它的波长和激发光的波长一致，因此容易辨认，当样品溶液除去胶粒和气泡后，丁铎尔散射即可消除。

散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，对荧光的测定干扰更大，必须采取措施消除。

瑞利散射光波长与激发光波长相同，只要选择适当的波长即可将其消除。拉曼散射光波长与激发光波长有差值，并且随激发光波长改变而改变，而荧光物质发射的荧光波长与激发光波长无关，即可通过选择适当的激发光波长把物质的荧光与溶剂拉曼散射光区别开来。有时溶剂的拉曼光谱与物质的荧光光谱相重叠影响荧光测量，故激发光的选择一方面要考虑较高的灵敏度，另一方面要使溶剂的拉曼散射光与荧光峰相距远些，以避免干扰。

表5—2为水、乙醇、环己烷等常用溶剂在不同波长激发光照射下拉曼光的波长。可供选择激发光波长或溶剂时参考。

表5-2  在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长（nm)

第三节 荧光分析仪器

一、仪器的主要部件

测量荧光强度的仪器有荧光光度计和荧光分光光度计。前者结构简单，价格便宜；后者构造精细，不仅定量测定的灵敏度和选择性高，还可用于荧光物质的定性鉴定。尽管仪器的类型不同，但其基本部件均包括下列五个部分：①激发光源；②单色器；③样品池；④检测器；⑤放大指示器。图5-7是荧光计示意图。

图5-6 荧光计的示意图

由光源发出的紫外可见光通过激发单色器分光后，照射到样品溶液上，在波长λ_ex的紫外可见光激发下，样品发出荧光。为了防止激发光的干扰，在与激发光垂直的位置上检测样品的荧光。样品发出的荧光通过发射单色器分光后照到检测器上，检测器得到相应于各种荧光波长λ_em时的荧光强度F。

1．激发光源  理想的光源应能发射含有各种波长的紫外光和可见光，光的强度不仅足够大，并且在整个波段范围内强度一致，但是理想的光源不易得到，通常用高压汞灯、卤钨灯和氙灯。高压汞灯产生强烈的线光谱。滤光片荧光光度计的光源大都用汞灯或卤钨灯(碘钨灯或溴钨灯300nm～700nm)作光源。

高压氙灯是一种短弧气体放电灯，是荧光分光光度计应用最广的光源。灯内装有氙气，通电后氙气电离，同时产生较强的连续光谱，波长在250nm～700nm之间，而且在整个波段内，发光强度几乎相等。由于氙灯的启动电压约20kV－40kV，所以当仪器配有计算机时，应使氙灯点着稳定后再开计算机．

以激光为光源的荧光分析法，可极大地提高荧光分析的灵敏度，目前激光诱导荧光光谱分析已达到单个分子检测水平。

2．单色器  测定荧光的仪器需有两个单色器，第一单色器在光源与样品池之间，称激发单色器，其作用是让所选择的激发光透过照射在被测物质上。第二单色器在样品池和检测器之间，与激发光源成90度角，称为荧光单色器，它可以把容器的反射光、溶剂的散射光以及溶液中杂质所产生的荧光除去，只让特征波长的荧光通过而照射于检测器上。

荧光光度计采用滤光片作单色器，分光能力较差，不能进行激发光谱与荧光光谱的扫描。滤光片有三种: ①截止滤光片，用于截止杂散光或不需要波长的光，为发射单色器；②带通滤光片，实际上有两个截止滤色片组成,允许通过某一波长的光并有一定的谱带宽度,透光率比截止滤色片差, 为激发单色器；③干涉滤光片，由两个玻璃板之间附着两层或多层金属膜制成。每一层膜用一个无吸收物质作隔膜与下一层金属膜分开。金属膜之间的距离决定了透过光的波长。使用干涉滤色片能得到较窄的带宽和较高的透过率。

荧光分光光度计用光栅作单色器，光栅的分光能力强，且色散是线性的，便于进行光谱扫描。但是色散后的光线有级数，须加前置滤光片加以消除。

3．样品池  荧光测定用的样品池一般用石英制成，因为玻璃会吸收320nm以下的紫外光。样品池的形状以散射光较少的方形为宜。低温荧光测定时可在石英池外套上一个盛放液氮的石英真空瓶，来降低温度。

4．检测器  用紫外可见光为激发光源时产生的荧光多为可见荧光，强度较弱，因此要求检测器的灵敏度较高，通常采用光电倍增管。目前，光电二极管阵列式检测器也已用于荧光分光光度计。

5．放大指示器  电信号经放大器放大后可由表头指示或数字显示荧光强度，由记录仪记录结果。

二、仪器的类型

荧光仪器主要有荧光光度计和荧光分光光度计两类。

（一)荧光光度计  用溴钨灯或汞灯作光源，单色器为滤光片，通过第一滤光片可获得一定通带宽度的激发单色光，通过第二滤光片可得到所需要波长范围的荧光。该类仪器一般用光电管为检测器，电信号经放大后用微安表指示出来。结构简单，价格较便宜，但只适用于物质的定量分析。

另一种比较高级的荧光光度计是第一单色器用滤光片，第二单色器用棱镜分光，这样的仪器虽然不能得到激发光谱，但可得到荧光发射光谱，而且定量分析的灵敏度、选择性得到提高。

（二)荧光分光光度计  荧光分光光度计采用氙灯作光源，通过狭缝经光栅分光后照射到被测物质上，发射的荧光经第二单色器分后，用光电倍增管检测荧光强度，经放大器放大后由记录仪记录结果。它不仅定量分析的灵敏度高和选择性好，而且可以扫描绘出物质的荧光激发和发射光谱，进行定性分析。

第四节 荧光分析方法和应用

—、定性分析

荧光物质的特征光谱有激发光谱和荧光光谱两种，而紫外可见分光光度法中，只能得到被测物质的一种特征吸收光谱，因此，用荧光分析法做物质鉴定时可靠性更强。定性方法是将其特征光谱的形状、波长范围与标准物质进行比较，从而确定待测物质与标准物质是否为同一物质。

例如，大气烟尘中苯并(a)芘的测定。样品分离纯化后，在荧光分光光度计上固定激发波长在386nm，第二单色器扫描，获得样品的荧光光谱。然后固定荧光波长在407nm，第一单单色器扫描，获得样品的激发光谱。如果确系苯并(a)芘，则测得的荧光光谱、激发光谱应和苯并(a)芘标准品的光谱完全一致。

二、定量分析

荧光分析法更多用于荧光物质的定量分析，根据荧光强度与该溶液的浓度成正比的定量关系，在一定的浓度的范围内，可以采用标准曲线法和直接比较法进行定量。

（一)标准曲线法

取已知量的标准被测物质，用与样品相同的方法处理，配制一系列标准溶液，依次测量其荧光强度。以荧光强度对标准物质含量绘制标准曲线。测出样品溶液的荧光强度，即可由标准曲线查出样品中荧光物质的含量。

标准曲线在应用过程中要不断进行校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则需改用另一种稳定而且荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如测定维生素B₁时，用硫酸奎宁为基准；测定维生素B₂时，用荧光素钠作为基准。

（二)直接比较法

要求待测物和标准物质的浓度必须在线性范围之内。测定时，配制一已知浓度的被测物标准溶液，与样品用相同方法处理后，测定得标准溶液和样品溶液的荧光强度分别F_s和F_x，求得样品中荧光物质含量。若空白溶液的荧光强度为F₀，则

（5-9)

  （5-10)

在同一条件下k为常数，则有

   （5-11)

三、荧光分析法的应用

荧光分析可以利用直接荧光分析和间接荧光分析测定许多类有机化合物和无机物。对于自身能够发出荧光的物质可用直接荧光法测定。对于许多不发荧光或荧光效率很小的有机物和无机物，则通过化学反应将其转变成荧光物质后进行间接测定。因此，荧光分析广泛应用于卫生检验、临床检验、生物化学和环境保护等领域。

（一)有机化合物的荧光分析

芳香族及具有芳香结构的有机化合物在紫外光照射下大多数能发荧光。多环芳烃普遍存在于大气、水、土壤、动植物及加工食品中，目前已知有200多种具致癌性的多环芳烃，苯并(a)芘是致癌活性最强的一种，通过萃取或色谱分离后

进行荧光测定，方法可靠，测定最低浓度可达0.1mg/L。

食品中维生素含量的测定是食品分析的常规项目。几乎所有种类的维生素都可以用荧光法进行分析。氨基酸、蛋白质的荧光分析也都是很灵敏的常用方法。

对于某些弱荧光性物质甚至不发荧光的物质，如甾族化合物，经浓H₂SO₄处理后，可使不产生荧光的环状醇类结构，改变为产生荧光的酚类结构。几种用于有机化合物的荧光试剂见表5-3。

表5-3  用于有机化合物测定的荧光试剂

(二) 无机元素的荧光分析

能产生荧光的无机物仅有铀盐等少数几种，但许多金属或非金属离子可以和有机化合物形成荧光配合物,从而进行荧光分析。目前利用该法可进行荧光分析的无机元素已近70种。常见的几种荧光测定试剂见表5-4。

表5-4 几种荧光测定试剂

（三)基因研究及其检验

遗传物质脱氧核糖核酸（DNA)，自身的荧光效率很低，一般条件下几乎检测不到DNA的荧光。因此，通常选用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前，典型的荧光分子探针为溴乙啶（ED)。此外也使用Tb³⁺、吖啶类染料、钙的配合物等。在基因检测方面，已逐步使用荧光染料作为标记物，来代替同位素标记，从而克服了同位素标记带来的污染、价格昂贵及难保存等不足。

（四)时间分辨荧光免疫分析

近年来，时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)作为一种新型的非放射性免疫标记技术，其应用不再局限于临床诊断，现已渗透入生物学研究的各个领域。

在通常的荧光测定中，主要讨论荧光强度和荧光波长的荧光光谱图的信息应用，由于测试样品中含有多种荧光成分，背景干扰强，因此成了荧光分析法大范围推广使用的瓶颈。然而荧光在发射过程中还有寿命信息，TRFIA巧妙地利用了荧光强度和时间的变化的关系及荧光寿命差别的信息，除了能测定荧光物质的荧光寿命外，还可以消除干扰物和背景荧光的干扰，以及荧光混合物中多组分含量分析。当混合物中多组分的荧光寿命差超过4ns时，便可进行多组分同时测定。

TRFIA具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点。现已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。

第五节 磷光分析法简介

分子磷光分析法与分子荧光分析在原理、仪器和应用等方面非常相似，与荧光相比，磷光具有如下三个特点：①磷光辐射的波长比荧光长，这是因为分子的T_l态能量比S₁态低；②磷光的寿命比荧光长。由于荧光是S₁—S₀辐射跃迁产生的，这种跃迁是自旋许可的跃迁，因而S₁态的辐射寿命通常在10^-7～10^-9s；磷光是T₁—S₀跃迁产生的，这种跃迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小得多，因而辐射寿命要长，大约为10^-4～10s；③磷光的寿命和辐射强度受重原子和顺磁性离子存在的影响极其敏感，使磷光增强，荧光则相反。

一、低温磷光

由于激发三重态的寿命长，这使三重态去激发过程中的无辐射跃迁，如分子内部转化、激发态分子与周围的溶剂分子间发生碰撞和而能量转移以及发生某些光化学反应等的概率增大，使磷光强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去激发过程的影响，通常应在低温下测量磷光，以减少无幅射跃迁对磷光发射的影响。

低温磷光分析中，液氮是最常用的冷却剂。因此要求所使用的溶剂，在液氮温度(77K)下对所分析的试样应具有良好的溶解特性，本身又容易制备和提纯，并在所研究的光谱区域内没有很强的吸收和发射。最常用的溶剂是EPA，它由乙醇、异戊烷和二乙醚按体积比为2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶剂IEPA(由EPA：碘甲烷＝10：1组成)，有利于系间跨越跃迁，可以增加磷光效应。

二、室温磷光

由于低温磷光需要低温实验装置，并且溶剂选择以及应用范围受到一定的限制。所以目前发展了多种室温磷光法(RTP)。有固体基质室温磷光法(SS-RTP) ；胶束增稳的溶液室温磷光法(MS-RTP) 执业护士网；敏化溶液室温磷光法(SS—RTP)。

胶束增稳的溶液室温磷光法(MS-RTP)当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去激发过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。利用胶束稳定的因素、结合重原子效应和溶液除氧，是MS-RTP的三个要素。

三、磷光分析法应用

磷光分析在无机化合物测定中应用较少，主要用于药物分析、环境分析等等领域的有机样品。一些有机化合物的磷光分析见表5—5。

表5-5  一些有机化合物的磷光分析^*

*WM 为水甲醇溶液；DL为检出限（g/ml)

  (李珊，康维钧)