胰岛素结构与功能的研究进展
0040120 任海霞 0040130 翁静艳 0040132 夏苏捷
摘要 近年来，胰岛素的结构与功能进展很快，本文就胰岛素的受体结合部位及其与受体的相互作用进行了讨论，并且介绍了具有临床意义的速效、长效和高效胰岛素类似物的研究概况。此外，还对胰岛素结构改造的最新研究进展作了介绍，并对这些改造物的前景作了展望。
关键词 胰岛素结构，胰岛素类似物，胰岛素受体，速效胰岛素，长效胰岛素
胰岛素，自从被国外医学家成功提取并应用于临床以来，已经挽救了无数糖尿病患者的生命。它是一个多生理功能的蛋白质激素, 由胰脏 ß-兰氏小岛细胞核糖体合成。其主要功能是通过调节外周组织的葡萄糖摄取和代谢及在肝脏中葡萄糖的产生和储存, 以维持体内葡萄糖的平衡。体内胰岛素水平较低或胰岛素与其受体结合率不高会引起的糖尿病，所以将胰岛素进行结构改造以提高其吸收或与受体结合的能力一直是研究者们研究的重点。下面主要介绍这方面的研究进展。
1、胰岛素分子结构及其受体结合部位
1.1胰岛素的分子结构
胰岛素分子[1]是一种酸性蛋白，相对分子量为6000u ，等电点为5.3。一个胰岛素分子由两条肽链（A、B)组成。其中A链呈酸性，由21个氨基酸残基组成；B链呈碱性，由30个氨基酸残基组成。两条链间通过S—S连接。不同种动物的B 链某特定部位的氨基酸序列有差异，但结构上、功能上似乎没有呈现出种属的差异性。下面就是人胰岛素的一级结构（图1)：
胰岛素的具体结构特点有：A链中A12-A15为一个非标准的右手螺旋，其它氨基酸残基为不同伸展程度的肽链构象； B链中B1-B6是伸展的折叠肽链。B8为Gly,肽链发生转折，B9-B19是右手螺旋，B12- B23呈现U形转折（β转角)，B23–B27为一段伸展的β构象。可见，在整个B链中，B9-B19螺旋段构成肽链的基本骨架结构。从外观上看，胰岛素分子A链自身卷曲，B链则从三面将A链包住（图2)[3]。
图2：胰岛素单体分子的板带模型
其中深色为A链，浅色为B链
1.2 胰岛素的受体结合部位
中国科学院梁栋材院士[4]在研究了大量胰岛素衍生物的空间结构的基础上，提出了两性表面模型（图3)，指出胰岛素与受体的结合相互作用发生在胰岛素分子的一个表面很大的两性表面上，这个两性表面的中部是一个由疏水性残基构成的疏水表面，其面积大约为1.5nm2 ,而分布在该疏水表面周围的则是一些亲水残基和带电荷的侧链基团，它们构成了两性表面的亲水区域带。其中疏水表面上的芳香环对整个分子的结合有重要意义。它除了承担疏水的相互作用外，还承担着识别受体以及结合受体过程中和结合后诱发分子构象变化的作用。试验表明，其它基团或主链部分的转换只要使这个疏水表面仍能维持1.5nm2左右，就不会过于影响胰岛素分子和受体的相互作用。另外，两个胰岛素分子可依靠分子间非极性侧链基团的疏水作用形成二聚体，胰岛素的这个疏水表面也是形成胰岛素二聚体的位置。
图3：胰岛素分子中可能与其受体结合的一个表面
虚线包含部分为疏水区域，周围分散着一些极性基团
由于胰岛素发挥其生理功能的第一步是与其在细胞膜表面的受体结合，因此了解胰岛素分子中的受体结合部位的组成和结构，对研究胰岛素的结构功能关系、作用机制和信号传导的分子基础是十分重要的。
通过胰岛素及其类似物与受体相互作用的大量研究，已建立了比较公认的胰岛素分子的受体结合部位，主要有B12、B16、B24、B25、B26等残基形成的疏水面以及A1、A2和A3等残基（称受体结合部位１)。近年来认为胰岛素六聚体形成面的A13Leu和B17Leu也参与受体结合，称“受体结合部位2”，在分子上处于“受体结合部位1”的对面（图4)[2]。
图4：人胰岛素两个受体结合部位在分子上所处的位置
其中一部分被B链C端所掩盖
胰岛素与IR结合时，B链C端可能发生远离A链N端的构象变化，使A2、A3暴露，成为活化形式。如果将胰岛素A链N端与B链C端共价交连，观察到随连接肽长度的增加，其于IR结合的能力呈现上升再下降的变化[5]。
迄今,人们已获得了约300多种胰岛素类似物。在这些类似物中，有些表现出比天然胰岛素更优越的性质，展现出光明的临床应用前景。
2、速效胰岛素
20世纪90年代初，国外学者通过对胰岛素结构和成分的深入研究发现，胰岛素B链羧基端的第28和29两个位点，是使胰岛素容易聚合成六聚体的关键部位。而胰岛素生理功能的表现，必须从多聚体解离成单体，因为胰岛素是以单体形式与其受体结合的。因此，他们认为：改变这些部位的氨基酸组成，避免胰岛素形成聚合体，有可能改变胰岛素的理化和生物学特征，从而有可能生产出较常规人胰岛素更适合生理需要的类似物。
此后，他们应用基因重组技术合成了速效胰岛素类药物，即优泌乐（Rapilysin)[6]。它是将人胰岛素B28位点的脯氨酸(Pro)和B29位点的赖氨酸(Lys)位置互换而形成的胰岛素类药物。这种互换改变了B链末端的空间结构，减少了二聚体内胰岛素单体间的非极性接触和β片层间的相互作用，使胰岛素的自我聚合特性发生改变，注射后能较快分解，因此起效较快、作用消失迅速。
诺和锐(Nove Rapid)[6]是另一种速效胰岛素类药物，也是基因重组技术的应用成果。它是用门冬氨酸(Asp)取代了胰岛素B28位点的脯氨酸。这种改变，旨在通过引进电荷排斥来阻止胰岛素单体或二聚体的自我聚合。
上述两种药物已被FDA批准上市。
[B9Asp,B27Glu]人胰岛素的作用机制与诺和锐相类似。Kang等报道了在正常人和糖尿病人体内进行实验的结果，均有明显的速效作用[7]。
DKP胰岛素即［B10Asp,B28Lys,B29Pro］胰岛素，除了具有优泌乐的优点外，由于B10Asp突变的影响，DKP胰岛素的生物活力比天然胰岛素有所升高，它的受体结合能力是猪胰岛素的两倍[8]。
3、长效胰岛素
鉴于短效胰岛素需要每日多次注射，给糖尿病患者带来诸多不便，研究者一直试图通过缓皮下组织的吸收来延长其作用时间。
Glargine是通过基因重组技术生产的长效胰岛素类药物。它与普通胰岛素的不同之处在于，其A链21位的天门冬氨酸（Asn)被甘氨酸(Gly)所取代；B链羧基端的31和32位点连接了两个www.med126.com/job/精氨酸。经过上述分子改变后的胰岛素，在酸性条件下，呈无色透明溶液状；而在生理条件下，溶解度则很低。其皮下注射后立即聚合、溶解度降低，形成glargine沉淀物，因此被延迟吸收，作用时间也被延长[6]。
Detemir或称NN304，是一个意义非常重要的可溶性长效胰岛素类药物。它是用化学方法在普通人胰岛素B链第29位点的赖氨酸之ε位上，以共价链连接了一个14碳的游离脂肪酸侧链，并去掉了邻近第30位点上苏氨酸残基后形成的。这些改造使Detemir发生了与普通人胰岛素不同的变化：注射后，被皮下组织吸收缓慢；跨内皮转运速度下降；入血后，能与白蛋白结合并循环于血液中，延迟了与胰岛素受体的结合，从而使其半衰期延长[6]。
[A21Gly,B27Arg,B30Thr酰胺]人胰岛素，由Novo研究所研制，称Novosol Basal,是目前已知在血液中半衰期最长的一种类似物，可达35.3h，远远超过了现在临床使用的胰岛素不溶物制剂。Novosol Basal已进行临床实验。它的长期效应主要在于B链羧端被酰胺化和B27位突变后均促使其等电点上升（pH5.4升至pH6.8)，而A21位突变使其在酸性溶液中也不会脱酰胺，保证了它的稳定性，这样制成pH3.0的可溶制剂。注射后能在生理pH条件下形成结晶，延缓了吸收，半衰期因而延长，有利于持续而低剂量胰岛素基础水平的维持[9]。
4、高效胰岛素
高效胰岛素类似物的研究开展较早。如［B10Asp］人胰岛素于1987年由Schwartz等合成，它的体外生物活力和受体结合能力是人胰岛素的5倍[10]，[B10Asp(去B26～B30)B25Tyr酰胺]人胰岛素是目前为止人们获得的活力最高的胰岛素类似物，它的体外活力是人胰岛素的11.7倍[11]。此外，Burke等[10]还观察到有些突变胰岛素若再增加一个B10His突变为Asp，则活力提高2～5倍。
虽然目前已获得一些高效胰岛素，它们的体外生物活力和受体结合能力是天然人胰岛素的几倍或十几倍，然而它们的体内活力并不比天然胰岛素高。例如Ribel等报道，虽然[B10Asp]人胰岛素的体外活力是天然产物的5 倍，但在体内它只表现出与人胰岛素相同的活力。对这种现象的解释是：体内胰岛素的清除是通过其受体介导的[10]，血液中的胰岛素首先和受体结合，然后才被降解清除掉，换言之，胰岛素类似物与胰岛素受体的亲和性越高，它被清除的速度越快，在血液循环中存留的时间越短。因此，虽然这些类似物具有较高的体外生物活力和受体结合能力，但进入体内后由于被清除的速度加快，而表现不出高生物活力。因此，目前的高效胰岛素在应用方面尚未显示出优越于天然胰岛素之处。不过Bristow[12]认为，由于人体不同组织对胰岛素作用的反应不同，因而有着不同受体结合能力的胰岛素类似物，可能在临床有不同的特殊用途。
5、最新研究成果与前景展望
从基础理论研究出发，将胰岛素进行结构改造并分析、对比其作用效果有助于进一步全面、正确了解胰岛素的性质及其结构与功能的关系，从而为改善胰岛素的治疗学性质作准备。现就对目前最新的一些研究成果进行介绍，其中有些重组胰岛素表现了极大的应用前景。
5.1 胰岛素类似物的研究新进展
有实验表明，当B25 Phe被Leu 取代或被Ser取代后，虽然构象的变化不大，但使分子的生物活性严重丧失，降低到1%左右；而B24 Phe 无论被Leu取代还是被Ser取代后，总可维持20%左右的活力。这是由于B25的Phe有很大柔性的缘故。因为它的芳香侧链被烷基取代后对周围构象无明显影响；但苯环共轭平面上的π电子云的丢失则可能影响整个分子识别受体分子以及与受体结合后的构象变化和相互作用，导致生物活性几乎全部失去。而B24的Phe构象是十分保守的，一旦它的苯环被取代后，疏水表面结构将被破坏，并致使与受体结合能力丧失70- 80%。
近来，刘滨等[13]通过基因定点突变法中的单链DNA法得到一种重组人胰岛素[B18Ile],其与受体的结合能力为猪胰岛素的82%，保留了与猪胰岛素基本相www.med126.com同的体内生物活力。经实验结果和分析表明B18Val可能不是胰岛素表现生物功能所必需的。
张弘等[14]设计了胰岛素单链前体[B22Asp、B28Lys、B29Pro、B30Lys]B链-Ala-Lys-A链，通过酵母分泌表达和胰蛋白酶水解得到一种抗胰蛋白酶的单体胰岛素[B22Asp、B28Lys、B29Pro、B30Lys]人胰岛素。它与受体的结合能力约为猪胰岛素的6%，而体内生物活力保留50%。该突变体分子中B28Pro和B29Lys互换，减少了分子的自身结合能力，在生理条件下是单体，因此具有速效胰岛素的特征。B22位变为Asp后能够抵抗胰蛋白酶的进一步酶解，在体内可能具有较长的半衰期，因此该突变体可能具有长效胰岛素的潜能，从而成为长效单体胰岛素。由于该类似物保留了相当的体内生物活力，并且下游处理简便，故具有一定的应用前景。
黄一丁等[15]用固相合成和基因定点突变方法, 分别制备了保留高生物活力的［A13-14GABA,A21Ala］猪胰岛素和［A3Thr］人胰岛素.经实验测定，［A13-A14GABA,A21Ala］猪胰岛素的受体结合能力和体内活力,分别为天然猪胰岛素的50%和59%; 为［A21Ala］猪胰岛素的83%.该结果表明，在［A13-14GABA,A21Ala］猪胰岛素的主链中, GABA主链N-C-C-C-C的作用可能类似于A13-A14主链N-C-C-N-C-C；A13Leu和A14Tyr的侧链可能不是胰岛素与受体结合所必需的，非编码的γ-氨基丁酸能够取代胰岛素中位于A13-A14 位置的二肽Leu-Tyr。
[A3Thr]人胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力, 约为天然胰岛素的50%, 小白鼠惊厥实验表明其体内活力基本上与天然胰岛素相同。该结果显示，高度保守且参与受体结合的A3Val可以被亲水的Thr取代。同时，胰岛素Wakayama表明, A3Val不能被比其仅多一个-CH2的疏水氨基酸Leu取代。该组研究人员据此推测，氨基酸的大小可能是主要的, 因为Val与Thr残基的大小几乎相同。当然, Thr的亲水基团-OH应该是被安置在一个不影响胰岛素结构的位置。结合之前研究，B12Val也可被亲水的Thr取代，这样,胰岛素分子中参与与受体结合的 2个疏水残基——A3Val和B12Val都可以被亲水的残基Thr取代。据此他们对传统的胰岛素分子的受体结合部位是由疏水氨基酸残基组成和胰岛素与受体的结合是疏水的相互作用的观念提出质疑。
丁金国等[16]用液相合成五肽Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B27K-去B链C端三肽胰岛素（B27K-DtrI,B27K-destripeptide insulin).实验测得B27K-DtrI的整体生物活力为标准胰岛素的80%，与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的（125±13)%，并证明B27K-DtrI自聚合性质降低，具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B27K-DtrI结构中，B27T被K取代，其优点是在酵母中表达其前体后，可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得，有希望发展成一种治疗糖尿病的胰岛素类药物。
5.2重组单链胰岛素的研究
为研究重组单链胰岛素的生物活性与连接肽之间的关系,用基因定点突变的方法分别以二肽A-K,七肽A-A-A-A-A-A-K和十二肽A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-K连接胰岛素的B30和A1,得到3个单链胰岛素分子PIP,[A]5PIP和[A]10PIP.它们的受体结合能力分别为胰岛素的0.14%, 14.3% 和11.1%, 体内生物活性与受体结合能力一致,而它们的促生长活性分别为胰岛素的17%,116.3%和38%.结果表明:(ⅰ)单链胰岛素也具有胰岛素的促代谢和促生长功能;(ⅱ)单链胰岛素与胰岛素受体的结合能力与连接肽的长度和氨基酸组成密切相关, 其受体结合能力随连接肽的改变,可由无到100%,进一步说明胰岛素与其受体结合时,B链C端远离A链N端是必需的;(ⅲ)单链胰岛素的促细胞生长能力也与连接肽长度和组成密切相关,且比其自身的促代谢能力强[17].
5.3 口服化学修饰胰岛素的发展
胰岛素口服易被胃肠道的低pH值和酶破坏，故在临床上有用的给药途径仅为皮下或肌肉注射，给病人带来了很大的痛苦和不便，因此研制口服胰岛素具有十分重要的意义。现在关于口服胰岛素制剂的研究方法有很多，采用化学修饰就是其中之一。
“华中科技大学药物研究所”以十四酰氯和十八酰氯作为配体对胰岛素进行修饰得到了两种化学修饰胰岛素：修饰胰岛素－1、修饰胰岛素－2。对普通胰岛素和修饰胰岛素的降血糖作用进行比较，发现胰岛素经过化学修饰之后仍然保持了原有的生物活性；且修饰胰岛素－2比修饰胰岛素－1的降血糖作用稍强些，但无显著差异。再对胰岛素和修饰胰岛素的抗胰蛋白酶降解能力进行比较，发现胰岛素被胰蛋白酶水解8h后，已基本上不具有降血糖作用；而修饰胰岛素被胰蛋白酶水解8h后，仍有一定的降血糖作用[18]。
以上结果表明用化学修饰胰岛素的方法对胰蛋白酶作用胰岛素的位点加以保护之后，并不改变胰岛素原有的生物活性，仍然具有同样的降血糖作用；同时修饰胰岛素有明显的抗胰蛋白酶降解能力。所以化学修饰胰岛素，在口服胰岛素研制方面将开辟一个更宽领域。
综上所述，随着基因定点突变等技术的发展，人们获得了大量胰岛素类似物。对于这些类似物的研究，不仅加深了人们对胰岛素结构和功能的关系以及胰岛素作用机理的了解，同时使人们获得了一些比天然胰岛素更为优越的药物，为改善糖尿病的治疗提供了光明前景。
参 考 文 献
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