医学蜱螨学实验指导
实验一 蜱标本的采集、制作与保存
【实验目的】
掌握蜱标本的采集、制作与保存基本实验技术。
【实验原理】
将蜱从其宿主体表或其洞（巢)穴和宿主自然孳生地捕捉获得后，对所采集标本进行收集，用生理盐水或人氏液清洗，用物理或化学方法固定，用脱水剂将标本脱水，以利于透明组织和保存玻片标本，最后进行标本封固以保存，使标本留存下来易于观察。
【实验材料】
1. 标本采集所需实验材料：采集旗、采集瓶、标签
2．标本制作所需实验材料：解剖镜、微型剪刀、平皿、5％KOH、系列酒精、冬青油、中性树胶、生理盐水
3．标本保存所需实验材料：65%～75%乙醇、磨砂瓶、标签
【实验方法】
1．采集
（1)拖旗法采蜱
用白色结实棉布或法兰绒，做成90cm×60cm旗子，一边固定在100cm～120cm竹竿上，竹竿两端栓上尼龙绳。拖旗法适用于林中或山间平坦处、河边漫滩、低矮或不长荆棘的草地。采集时将旗子平铺地面，拖拉绳子前进，每步行10～20步即可停下检查有无蜱类。
（2)摇旗法采蜱
摇旗法适用于密林地区，植被高度过膝，树木交错，枝杈横生，难能拖旗，可改为挥动旗帜的方法采集蜱类。
当发现有蜱，立即放入内，加塞，贴标签，供鉴定、饲养、检出、统计。如需调查密度，则在样地均匀地拖旗或挥旗，以每人每小时或每人每100m所捕获的蜱数统计，通常每一样地不少于30min或500m。
（3)从宿主采蜱
1)家畜：如牛、羊、狗、马、驴、骆驼、鸡等。
2)野生动物：如鼠类、鸟类、野兔、野鸡等。
3)人体：多侵袭头发、颈项、耳朵、腋下、多毛、易汗湿、多皱褶部位。
（4)动物栖息地采蜱
畜舍、圈栏、狗房、鸡窝、鸟巢、洞穴等。
（5)诱捕法采蜱
必要时，特意放出侦察犬或其它训养动物也可诱捕蜱类。
2．标本制作
（1)大体标本制作：成虫经过5％KOH浸泡。一般活蜱可直接浸入上液中，其体内的血液没有多大关系。但已固定的蜱，以体内没有血者为佳。可用细针在蜱体两侧无关紧要处扎数小孔，再用小平铲轻压蜱体，使被融解的内脏组织排出体外。用蒸馏水洗数次，每次半个小时左右。经酒精系列脱水，每液2h左右，冬青油透明，当见到冬青油中虫体透明即可用中性胶封片，以防时间过久蜱变脆易折断。
对于硬蜱，整体玻片标本适合教学用，不宜为分类鉴定之用。因为蜱体一经透明就失去鉴别的特征。而软蜱在分类鉴定时，可制成局部标本，即将虫体局部的背腹侧剪成三角形，或将背腹面分开，直接用胶封片。
（2) 内部构造标本制片 当活成虫体内血液消化时，用微型剪刀将蜱身体周缘剪开，再放入盛有生理盐水的小玻皿中，置于解剖镜下解剖。小心的将外皮去掉，留其内脏组织，如消化、生殖系统，按照昆虫的软组织制片法，进行固定、染色、脱水和封片。
3．蜱标本保存
（1)死蜱标本的保存技术
常用的方法是浸泡法，如酒精浸泡等。将捕获的蜱类用70~80℃的热水杀死，取出后稍干泡在65~75%酒精中长期保存或送交专门部门。酒精容量要比标本多4~5倍，使蜱类标本能固定在展肢状态。注意要标明标本来源、生境、宿主、时间和采集者等信息。有时为了进行DNA或RNA检测分析技术，这就需要采用DNAlater或RNAlater等溶液作专门处理。
（2)活蜱标本的保存技术
常采用的蜱盒和试管保存方法，可将洗净消毒容器，放入消毒处理的细沙上面覆盖棉花，再覆盖滤纸片。然后放入反复摺皱的滤纸条（事先蘸有防霉剂如新霉素、氯霉素等)，接入活蜱可使蜱上下活动。容器口用棉塞或绢纱封闭。注意保持容器内的湿度，可每隔3~5天向沙子滴加无菌水，保持湿度在85%~95%、温度在15~22℃之间为宜。
【实验结果】
采集到蜱标本，成功进行标本制作与保存。
【注意事项】
1. 虫体在固定之前应清洗时应避免对虫体的形态和结构造成损伤。
2. 标本脱水时，应用系列酒精使标本从低浓度到高浓度逐步脱水。
3. 为防止脱水剂挥发或吸水等外界影响，脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行。
4. 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象，必要时候可重复脱水。
5. 固定剂新鲜配制使用为宜，如需保存应避光、阴凉保存。
6. 封固时盖玻片的大小以其周围留有约为2 mm左右距离为宜。若太靠近在载片边缘，则易使染色标本受空气中酸的作用而褪色。
7. 封固剂的用量应根据标本的大小和盖玻片的大小决定。若封固液不足应从盖玻片边缘补足；若滴加过多时，待封片干后，将外溢的封固液去除。
实验二 蜱的解剖与细胞培养
【实验目的】
掌握蜱的解剖基本实验技术，熟悉蜱的细胞培养技术。
【实验原理】
对蜱进行解剖以掌握蜱的内部系统结构。通过体外给予蜱特定的理化条件和必需的基本营养成分进行细胞培养，以满足多方面研究和防治工作的实际需要。
【实验材料】
1. 蜱解剖所需实验材料：解剖镜、解剖针、解剖刀、玻片、平皿、生理盐水或磷酸缓冲液、眼科镊子、吸管、烧杯、石蜡、松香、酒精灯、小试管、试管架、胚胎皿、小烧杯等。
2. 蜱细胞培养所需实验材料：绢纱袋、注射器芯、平皿、RPMI1640培养基、0.5%新洁尔灭、75%酒精、胰酶、EDTA溶液、无Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液
【实验方法】
1．解剖
首先是躯体固定，取一滴加热融化的速干胶滴在洁净的玻片上。将蜱背面向上，头向前，用眼科镊子将其平放在胶滴中间，1min左右即粘固在玻片上。然后是切除背板、背板的切除，从肩突开始，沿体侧沟用手术刀做一个切环，直至对侧肩突，再在假头和背板上缘做一横切。接下来是摘除背板，用眼科镊子左手夹注已切开的背板左上侧，右手用解剖针小心地由上往下紧帖背板，剥离粘在其上的支气管束和结缔组织，这时应将玻片放在盛有生理盐水的平皿内。右手边剥离左手边向下拉，直到取尽为止。最后是取出消化器官等。以消化器官为例，用镊子夹住中肠前部，用解剖针在食管部位将肠管切断，再慢慢由上向下将剥离的消化器官取出，包括马氏管、直肠囊、唾液腺、卵巢、睾丸等一起取下，分别放于胚胎皿中，依工作需要进行固定、组织切片或细胞培养。
2．细胞培养
以蜱卵为例，可先将蜱卵放于绢纱袋中，用蒸馏水漂洗2~3次，然后用0.5%新洁尔灭消毒10min，再用蒸馏水漂洗2~3次，放入75%酒精中消毒10min，再用蒸馏水漂洗2~3次，在用1640液漂洗1洗后于小平皿内用注射器芯挤压破碎，去出卵壳后，接入培养液中进行原代培养。如需增加原代细胞的贴壁能力，可先在培养瓶中放入胎牛血清使瓶壁薄薄覆盖，以增加原代细胞的贴壁能力。待细胞不断生成，贴壁成单层后，可用胰酶消化分散细胞，可进行继代培养。继代培养时，首先要分散细胞，可采用胰酶溶液或EDTA溶液进行分散。分散时可先将原培养液弃去，用无Ca2+、 Mg2+ 的Hanks溶液洗2次，再加入胰酶消化液28℃消化2~5min，当细胞间隙松动，肉眼可见单层细胞呈“发毛”现象时，小心弃去消化液，反复摇动培养瓶，见细胞脱落时，将瓶用手掌轻轻一拍，使大片细胞脱落，然后用培养液将细胞从瓶壁吹下，分散成单个细胞，再依据细胞量进行分瓶培养。蜱细胞的冻存和复苏，依照缓冻速复的原则进行。
【实验结果】
1. 成功解剖蜱，见其内部系统结构，如下图肩板硬蜱：
图2-1 肩板硬蜱I. scapularis内部系统解剖图
2. 对蜱卵成功培养。
【注意事项】
1. 速干胶不宜太热将标本烫坏，也不宜太凉粘不住，用玻璃棒蘸起成滴状即可。
2. 进行标本解剖时应将玻片放在盛有生理盐水的平皿内，以覆盖住蜱标本的水量即可，可避免内脏因干枯而破裂。
3. 原代培养时因组织和细胞刚刚离开机体，在人工环境中需要培养液更接近它原来的体液才有利于其生存和培养，应适当加大小牛血清或胎牛血清的含量（15%~30%)，必要时可加入蜱组织研磨液，以提供生长激素等弥补培养基营养差异。
4. 胰酶溶液要用无Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液配制。
实验三 革螨的标本及染色体标本的制备
【实验目的】
（一) 掌握革螨成虫的形态特征。
（二) 掌握革螨成虫标本的采集、固定、制作、染色和保藏。
（三) 掌握同工酶技术在革螨中的应用，熟悉了解其他新技术、新方法在革螨诊断中的应用。
一、内容：
（一) 示教与观察：
1． 革螨成虫
2． 革螨虫卵
（二) 技术操作：
1． 革螨的采集
动物巢穴和外界环境：动物巢穴中的革螨，无论种类、数量、虫期、生态均较宿主体上的多而复杂。采集标本时，将巢穴内容物（窝草、粪土、杂物等)都收集到白布袋中，扎紧袋口并标签。自由生活型革螨常栖息于枯枝烂叶下、稻草堆、住屋尘土、仓贮下层、粪堆等，按不同采集地点，分别存放于白布袋里，附上标签及编号。
2． 革螨的收集
收集革螨最好用电热集螨器方法，原理是利用热、干燥和光驱使革螨爬到集螨器下端的收集管里。如无集螨器或少量标本，则可放于搪瓷盘内用长镊子或解剖针逐一拨动被检物，同上法取螨，同样也要检查布袋中的螨。
采到的革螨一般可直接放入70%酒精中保存，若用加热约70℃的70%~80%酒精固定活螨或先用热水约70℃烫一下再放酒精中固定，则可使螨体附肢伸直，制成的标本美观且有利于鉴定。如需活螨则可直接挑入大型、中型或小型饲养器中饲养或观察。
3． 革螨染色体标本的制备
玻璃纸压片法
（1)取早期胚组织革螨卵，置于洁净的载玻片或盖玻片上。
（2)覆盖1cm2左右玻璃纸，玻璃纸预先浸于45%冰醋酸水溶液中数分钟。
（3)击破卵壳，使胚细胞铺展，静置2~3min。
（4)压片：在玻璃纸上再覆盖一片吸水滤纸，用拇指均匀用力压片。
（5)固定：滴加甲醇—冰醋酸（3:1)或96%酒精，反复固定3~5 min。
（6)染色：翻转玻璃纸，用pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液稀释的5%Giemsa液染色30 min。
（7)水淋洗，待干、镜检、摄影。
（8)如螨卵较多，采用气干法制片，效果更佳。
C分带——BSG法
（1)取新鲜制备尚未染色的染色体标本，置于0.2N HCl中室温下处理5 min。
（2)将标本浸入预热至50~60℃的5%Ba(OH)2水溶液中10 min，取出用热蒸馏水洗3次。
（3)于60℃的2×SSC（氯化钠17.54g，枸缘酸钠8.82g，蒸馏水加至1000ml)溶液中处理1h，水洗。
（4)用5%Giemsa液（同前)染色30~60 min。水洗、待干、镜检。着丝粒区呈深紫红色，染色体其他部位呈浅红色。
实验四 恙螨标本恙虫病东方体DNA的提取
【实验目的】 掌握恙螨标本恙虫病东方体DNA的提取
【实验原理】 在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase)存在的情况下。用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。蛋白酶的作用是消化蛋白质，膜蛋白的消化对破坏膜结构对细胞裂解有巨大的促进作用；巨大的基因组 DNA 都是缠绕在大分子的蛋白（核小体)上的，当蛋白质被蛋白酶消化变小后，基因组 DNA就被释放出来，这样一方面有利于蛋白质在纯化操作中的去除，一方面释放出更多的基因组 DNA 提高核酸的产量。
【实验材料】
1. 恙螨标本：恙螨蒸馏水浸泡2h，中间换水1次，洗净的恙螨置于研磨器，加适量的TE液研磨成悬液备用。
2．设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
3．试剂
1)分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。
2)10% SDS，蛋白酶 K（20mg/ml或粉剂)
3)乙醚，酚:氯仿:异戊醇（25:24:1)
4)其它试剂：无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
【实验方法】
1. 将恙螨TE研磨液(或其他标本的样品)吸取100μl于Eppendorf管中，加1/10体积的10%十二烷基硫酸钠（SDS)，混匀，置4℃冰箱过夜；
2. 加10 mg/ml 溶菌酶至终浓度为2mg/ml，冰浴30min，加10mg/ml蛋白酶K至终浓度为2mg/ml，55℃水浴1~2h。
3. 加入等体积的酚，混匀10min，离心5 000rpm 5min，吸出水相，用酚重新抽提一次；用氯仿-异戊醇重复抽提2次；
4. 加入1/20体积5M氯化钠，2倍体积的无水乙醇，-20℃冰箱过夜，离心去上清，加入70%乙醇振荡洗涤，去上清晾干，取20μl TE溶解沉淀，置-20℃保存备用。
【实验结果】
1. DNA溶液稀释20-30倍后，测定OD260 /OD280比值， 明确DNA含量和质量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳， 检测DNA的分子大小。
【注意事项】
1. 选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
2. 在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
3. 抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。
4. 取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。
5. 乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
6. 离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。
实验五 粉螨的采集、分离和保存
【实验目的】
学会粉螨的采集、分离和保存方法
【实验原理】
了解了粉螨的孳生环境采集粉螨，粉螨有避光爬附性，粉螨足跗节端部多具爪垫，在爬行时能附着在物体表面上。
【实验材料】
密封塑料袋5个、零号毛笔5支、平底搪瓷盘10个、黑纸板10个、凡士林、广口瓶（及软木塞)一个、指形管5个、脱脂棉、标签纸、炭素笔
【实验方法】
1. 采集：面粉厂的地脚粉，米厂的地脚米及其细糠，中药厂剁药车间的灰尘及碎药材渣、沫，中药材柜灰尘等；
2. 分离：选平底搪瓷盘盖和黑纸板（遮光黑纸板或三合板上贴黑纸)，或在平皿内垫一黑纸（小样本收集多采用平皿)，划定面积作为爬附区；将样本平展其上，置于光照之下，每隔15~20min把样本轻轻拍转到下一爬附区。若不计数每次爬附所获得螨数，只是为了收获粉螨，则可放置数小时（一般4~6h)，任其爬附。为了防止粉螨逃脱，在爬附区周围可涂一圈粘性物质。最后用毛笔收集螨。
3. 保存：将采集到的粉螨直接制成玻片标本，或放在保存液中留待以后制作。常用的两种保存液为：① 70％~80％乙醇；② 奥氏保存液（Oudemans fluid)。奥氏保存液的配方为：70％乙醇87份，冰醋酸8份，甘油5份。配制方法：将纯酒精用蒸馏水稀释到浓度70％后，加入冰醋酸和甘油，摇匀备用。
保存前，用零号毛笔（较小的粉螨可应用毛发针，毛发针即是在解剖针的针尖上粘l~2根毛发而成)“挑取”粉螨，放人浓度为50％~70％的热酒精（70~80℃)中固定，使其肢体伸展，姿势正常；再放入盛有奥氏保存液的指形管中，用脱脂棉塞塞口后，放人盛有同样保存液的广口瓶中，软木塞塞口。对于少量粉螨标本，可用青霉素针剂瓶盛放标本，盖子盖紧后用胶布封严。应用碳素墨水笔记录采集地点、时间、采集人姓名、寄主等，并随粉螨标本一起放入盛有保存液的指形管中或小瓶中保存，此法也称为双重溶液浸渍法。
粉螨保存瓶
【实验结果】收集并保存一定数量的粉螨
【注意事项】
1.所采集到的标本要根据时间、地点、材料的不同，单独装袋并加注标签。防止交叉感染。
2.注意掌握粉螨的爬附时间，时间太短还未附着好，时间太长粉螨容易粘在凡士林上。
实验六 粉螨标本的制作
【实验目的】学会制作粉螨标本。
【实验原理】粉螨可在封固剂中透明、保存，便于观察鉴定。
【实验材料】粉螨、毛发针、载玻片、盖玻片、100％乳酸20ml、蒸馏水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯胶结晶30g、无色指甲油、电吹风
【实验方法】
1．临时标本
（1)临时封固剂 ：50％～100％乳酸；将粉螨直接封入50％~100％乳酸中。
（2)将粉螨直接封入50％~100％乳酸中，放在约60℃的板上加热，冷却后即可。
2．永久标本
（1)永久封固剂 ：Faure改进的贝氏封固剂，配方为；蒸馏水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯胶结晶30g配制方法：按上述顺序混合后用绢筛过滤，著过滤不畅，可稍微加热后过滤。
（2) a. 直接用活螨制作标本，也可把保存液中保存的螨类，用吸管吸出并置滤纸上吸干以后制作标本。b. 用玻棒蘸取一些封固剂滴在载玻片中央2~3滴，将粉螨标本2~3只或更多置于封固剂中，用毛发针搅动，以清除粉螨躯体及足上的杂质，或者将分离的粉螨置于盛有清水的平皿内洗涤；c. 另取一块滴加一滴封固剂的载玻片，将“洗浴”后的粉螨用毛发针移到封固剂中，加盖玻片。d. 加热：电吹风法是利用电吹风的热风加热玻片标本，当封固剂出现气泡或开始沸腾时，停止加热，冷却后即可。此法容易掌握，制成的粉螨玻片标本透明，8足挺展。e. 玻片标本完全干燥后，在相对湿度较大的地区，可在盖玻片四周涂封一层元色指甲油，以防封固剂发霉和回潮。f. 在玻片标本的右方粘贴标签，标签上写明粉螨的学名和汉名、采集地点、采集时间、采集人姓名以及寄主等。
【实验结果】 制作出粉螨临时及永久标本
【注意事项】 封固剂的量要适当，以盖玻片盖上后正好铺满但不外溢为宜。对背面隆起的粉螨，可在封固剂中放人3~4块碎盖片后再加盖玻片，以免标本被压碎或变形。
螨类玻片标本制作程序
实验七 大学生蠕形螨流行病学调查
【实验目的】
1. 掌握蠕形螨检查的常用方法
2. 了解本校大学生蠕形螨的感染率
【实验原理】
蠕形螨寄生在人体的毛囊和皮脂腺内，利用挤压或粘贴的物理方法，将蠕形螨检出。
【实验方法】
（1)挤压刮拭法：用皮肤刮铲或蘸水笔尖后钝端从受检部位皮肤，如鼻沟、鼻尖部、颊、颏等部位直接刮取皮脂。刮拭时，用双手拇指相距lcm左右先压后挤压刮拭部位。将刮取的皮脂置于载玻片上，滴加适量70％甘油（一般1滴即可)，与之混匀，覆以盖片即可镜检；若要以皮脂定量计算感染度，可将刮取的皮脂放入特制的皮脂定量检螨器的定量糟内，然后取出置于载玻片上，按上述步骤涂片镜检，分别计数皮脂蠕形螨和毛囊蠕形螨的数量。
（2)透明胶纸法：嘱被检对象于睡眠前进行面部清洁（洗脸)，用宽1.2cm、长5cm的透明胶带贴于受检部位皮肤上，次晨揭下，贴回载玻片上镜检，如不够透明可于胶纸上滴加少许70％甘油。此法可以面积定量计算螨的感染度，具有定时、定点、定量的优点。
【实验材料】
皮肤刮铲、载玻片、透明胶纸、甘油等
【实验结果】
【注意事项】
1．挤压刮拭法操作时要注意力度，以免刮破皮肤，造成感染。
2．获得的标本要立刻镜检，以防蠕形螨虫体裂解。
实验八 疥螨标本采集与制作保存技术
【实验目的】
采集疥螨标本，再制片保存，以便进行形态学、生态学等科研及教学方面的研究。
【实验原理】
将生活在“隧道”中的活疥螨采集，可用于生态学研究，或将疥螨标本固定后再制片保存以便进行形态学研究及教学。
【实验材料】盖玻片与载玻片、6号注射针头、消毒手术刀、双目解剖镜、离心机、烤箱、蒸馏水、70％酒精或2％中性戊二醛、Berlese液或Hoyer液、聚乙烯醇、10％NaOH或KOH、60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精、加拿大树胶。
【实验方法】
1. 疥螨标本的采集：
(1)针挑法：选用消毒的6号注射针头，持针与皮肤平面呈10°～20°角，针口斜面向上，在“隧道”末端距螨点约1mm处垂直于“隧道”长轴进针，直插至螨点底部并绕过螨体，然后放平针杆(呈5°～10°)并稍加转动，疥螨即落入针口孔槽内，缓慢挑破皮肤或直接退出针头。
(2)解剖镜镜检法：让就诊者将手及掌腕部置于4×10或2.5×10的双目解剖镜视野下，检查者利用45°角入射的强光源(100瓦普通灯泡)，在其指侧及掌腕等嫩薄皮肤的皮损处观察，可清晰的看到疥疮患者的疥螨“隧道”及其内的疥螨轮廓和所在部位。然后，用消毒的尖头手术刀挑出。
采集的疥螨标本应先用70％酒精或2％中性戊二醛固定4～5d后再制片保存，以便进行形态学等方面的研究。
2. 疥螨标本的制作
(1)半永久性标本制作法：用Berlese液或Hoyer液等水溶性封固剂制片，按封固恙螨幼虫标本的方法操作。但是这些封固剂中的水合氯醛和甘油都会吸收水分，易使烤干的标本反潮、混浊。因此，必须用干漆或聚乙烯醇在盖玻片周围加边，以延长保存时间，若制片标本放置日久，标本出现过透明，使疥螨结构模糊，或盖玻片内产生气泡和霉菌时，可将盖玻片周围的干漆或聚乙烯醇用小刀轻轻刮掉，然后将标本插入载玻片缸内，用蒸馏水浸泡2～3d，至盖玻片与载玻片自动分离后，取出螨体，再用上述同样方法制片。
(2)永久性标本封片法：将固定后的标本，浸泡在10％NaOH或KOH水溶液中4～8h，然后水洗3次，每次10～20min，继而经60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精脱水，在每级酒精内的脱水时间为10min，再经冬青油透明后，用中性加拿大树胶封片。为了避免疥螨标本在操作中丢失，因此腐蚀、水洗、脱水、透明的全过程，要在离心沉淀的条件下进行，每次离心沉淀1 500 r/min，5min。借助解剖镜，选取完美的标本，用加拿大树胶封固后，平放在50～60℃的烤箱内烤干保存。
【实验结果】
采到结构完整、活动度好的活疥螨；制作的标本应观察到结构清晰、完整，透明度较好的疥螨。
【注意事项】
1. 针挑法在持针与皮肤平面呈10°～20°角，针口斜面向上，动作轻柔，否则得到的螨体将不完整。
2. 半永久性标本制作时必须用干漆或聚乙烯醇在盖玻片周围加边，以延长保存时间。
3. 永久性标本封片法时，为了避免疥螨标本在操作中丢失，因此腐蚀、水洗、脱水、透明的全过程，要在离心沉淀的条件下进行。
实验九、PCR技术在蜱螨学研究中的应用
【实验目的】
１、熟悉PCR技术的原理。
２、掌握PCR技术的操作步骤。
【实验原理】
PCR（Polymerase ChainReaction，聚合酶www.med126.com链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：（1)变性（Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；（2)退火（Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；（3)延伸（Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
一、 PCR反应中的主要成份
1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：（1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。（2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4（G+C)+2（A+T)。（3)四种碱基应随机分布，在3"端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。（4)引物3"端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。（5)在引物内，尤其在3"端应不存在二级结构。（6)两引物之间尤其在3"端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 （7)引物5"端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。 通常应在5"端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。（8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。（9)简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3"端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2～1.0µmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝OD260/ A（16000)+C（70000)+G（12000)+T（9600)
X： 引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
2、4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20～200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。
4、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102～105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100μl PCR反应中，1.5～2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶，灭活Taq DNA聚合酶的方法有：（1)PCR产物经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀。（2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。（3)99～100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6、反应缓冲液：反应缓冲液一般含10～50mmol/L Tris·Cl（20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3～8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二、PCR反应参数
1、变性：在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶（hotstart)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2、退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃～55℃，1～2min。
3、延伸：延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间（10～30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4、循环次数：
当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够医学全.在线，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103～105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109～1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的量可用下列公式表示：C＝C0（1+P)n。其中：C为扩增产物量，C0为起始DNA量，P为增效率，n为循环次数。
在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
第二节 材料、设备及试剂
一、材料
不同来源的模板DNA。
二、设备
移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪（PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备（电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。
三、试剂：
1. 10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0%Triton X-100。
2. MgCl2：25mmol/L。
3. 4种dNTP混合物：每种2.5mmol/L。
4. Taq DNA聚合酶5U/μl。
5. 其它试剂：1%琼脂糖，5×TBE。
第三节 操作步骤
一、PCR反应
1.依次混匀下列试剂
| H2O | 35μl |
| 10×PCR反应缓冲液 | 5μl |
| 25mmol/L MgCl2 | 4μl |
| 4种dNTP | 4μl |
| 上游引物（引物1) | 0.5μl |
| 下游引物（引物2) | 0.5μl |
| 模板DNA（约1ng) | 0.5μl |
混匀后离心5秒。
2.将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3.用94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10min，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
【注意事项】
1、PCR非常灵敏，操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2、吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。
3、加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4、应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
【思考题】
1、降低退火温度对反应有何影响？
2、延长变性时间对反应有何影响？
3、循环次数是否越多越好？为何？
4、如果出现非特异性带，可能有哪些原因？
皖南医学院 病原生物学硕士点
2006．7．3
