| 〈添加内容〉 实验一 普通光学显微镜的构造和使用细胞形态观察 目的要求 1．熟悉普通光学显微镜的结构和用途。 2．掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法。 材料用具 学生领用：显微镜、纤维片、蛙血涂片、猫脊神经节片、小肠上皮横切片 实验内容 一、录像：光学显微镜的构造和使用。 二、显微镜的构造和使用。 (一)显微镜的构造： 光学显微镜简称光镜，其作用是将微细结构做适当的放大，以便于观察。因它是生物学、医学、教学和科研的常用仪器，每个医学生都必须熟悉它的结构及其性能，掌握正确的操作要领。 普通光学显微镜种类很多，型号各不相同，无论外观上存在着多大差异，但其基本结构和功能大致是相同的，一般由机械部分和光学部分组成。(图1—1)
1．机械部分： (1)镜座：是显微镜的底座，呈马蹄型，用以支持和稳定整个显微镜。 (2)镜柱：是垂直于镜座上的短柱，起支持镜臂和镜台的作用。 (3)镜臂：位于镜柱上面的弓型部分，便于提取。 (4)镜筒：位于镜臂前方的圆筒，上端装有目镜筒，下端连接物镜转换器，它以齿状板与 调节器相接，可上下移动，调节焦距。 (5)倾斜关节：为镜柱和镜臂间的活动关节，可使镜臂在90度范围内做任意倾斜，以便 观察。但一般在使用时倾斜角不超过30度。 (6)调节器：在镜臂上方(有的位于下方)装有一大一小两对齿轮，大的为粗调节器，小的 为细调节器；转动它们可使镜筒做上下移动便于调节焦距。转动粗调节器可使镜筒做较大 距离或较快速度的升降，通常在低倍镜找物象时使用。转动细调节器可使镜筒做缓慢的升 降，常用它做精细的调节。从而得到清晰的物象。 (7)物镜转换器：位于镜筒下端一个可旋转的圆盘，一般装有3个不同放大倍数的接物 镜，旋转它可以调换不同放大倍数的接物镜，旋转盘边缘有一固定卡，当旋至物镜和镜筒成 直线时，就会发出“卡”的碰响声，此时可调节焦距观察玻片标本。 (8)镜台：又称载物台，是位于镜臂下前方的一块方形平板(有的为圆形)，用于承放玻片 标本，镜台中央有一圆形的通光孔，光线透过聚光镜由此孔射向标本。 (9)推进器：位于镜台后方和侧面边缘，上方一侧有两个旋钮，转动它可以调节推进器，使标本做前、后、左、右移动以便全面观察，有的显微镜无推进器，但装有弹簧夹，标本推进器上有纵横游标尺用以测定标本在视野中的位置。游标尺副标尺的一致点。如图1—2所示。可见副标尺的零点在主标尺的26—27之间，副标尺的6与主标尺的32一致，即6与主标尺上的一个分度线正对，此标尺所表示的数值即为26.6mm 2．光学部分： (1)反光镜：位于聚光器下方，镜柱前方的一个圆形平凹两面镜。反光镜可转向各方，以便收集各方向的光源，并反射到聚光镜上。 反光镜分平面镜和凹面镜两种： 平面镜：聚光力弱，适合光线较强时用。 凹面镜：聚光力强，适合光线较弱时用，因此实验室常用凹面镜。 (2)聚光器：位于镜台通光孔的下方，由聚光镜和虹彩光圈组成。镜柱的一侧装有螺旋，可调节聚光器的升降。上升时光线较强，下降时光较弱。 聚光镜：由几组透镜组成，位于镜台下方，其作用是聚集光线，增强视野的亮度。 虹采光圈：又称光阑，是由许多可活动的金属薄片叠合而成的圆环状结构，圆环外侧有一小柄，移动小柄可使光圈打开或关闭，以控制光线的强弱，使物象更清晰。 (3)物镜：嵌装在旋转盘上，一般分低倍镜、高倍镜和油镜三种。低倍镜头最短，油镜头最长，高镜头介于两者之间。镜头上标有不同放大倍数的符号，一般低倍镜头为5X，高倍镜头为40X，油镜头为100X，数字愈大其代表的放大倍数也就愈大。 (4)目镜：装在镜筒的上端，一般镜箱中配有几种不同放大倍数的目镜头，使用时可根据自己的需要，选择合适的目镜头装于镜筒中。目镜内常装有一根指针，以示观察玻片标本的某一部分。 3．显微镜放大倍数的计算： 显微镜放大倍数二目镜放大倍数X物镜放大倍数，如：目镜10X、物镜40X，其放大倍数为10X40：400倍。 (二)显微镜的使用： 从镜箱中取出显微镜时应右手握镜臂，左手托镜座。把显微镜放在身前稍左侧的实验桌上，座位高低要适宜，姿势要端正，镜座与桌边距离约2寸。观察显微镜标本时要学会两手同用(一手转动调节器，一手转动推进器)，两眼齐睁，左眼观察目镜标本。 1．低倍镜的使用： (1)先转动粗调节器，使镜筒上升或下降，再转动物镜转换器，使低倍镜头对准镜台孔，当听到轻微的碰响声时，说明目镜和物镜已成直线。 (2)对光：打开光圈，旋转聚光器的升降螺旋，使聚光器升到与镜台平齐，用左眼观察目镜，同时用反光镜的凹面对向光源，直到视野内光线明亮均匀为止。 (3)玻片标本的放置：将玻片标本有盖玻片的一面向上置于载物台上，玻片两端用推进 器或弹簧夹夹住，然后移动玻片，使标本对准镜台孔。 (4)调节焦距：从侧面注视低倍镜的位置，使镜筒缓慢下降，距标本0.5cm左右，用左眼观察目镜，使镜筒上升，直至视野出现清晰物象为止。如物象不在视野内，可稍移动玻片标本的位置(注意：玻片移动方向与物象移动方向正好相反)。 2．高倍镜的使用：按上述同样的操作程序，先在低倍镜下找到物象，将要放大的部分移至视野中央，转动旋转盘，调换高倍镜头，从侧面注视物镜，使高倍镜头对准通光孔，转动细调节器，直到物象清晰为止。 如按上述操作程序找不到物象时可考虑以下原因并予以纠正： (1)观察标本不在视野内，可调换低倍镜重新将标本移到视野中心。 (2)标本是否放反，应有盖玻片的一面向上方可找到物象。 (3)标本退色，应调节聚光器或光圈，以减少光的亮度。 在更换玻片标本时应先转开高倍镜取出玻片标本，然后再放置其它的标本。 3．油镜的使用(油镜的使用练习在实验四进行)：先在低倍镜下找到清晰物象后，再转换高倍镜观察，并使观察的物象位于视野中央，转动旋转盘，使高倍镜移向一侧，在玻片标本观察的部位上滴一滴香柏油，眼睛注视侧面，使油镜头与香柏油接触，左眼观察时微微调节细调节器，直到视野中的物象清晰为止。 油镜使用完毕，首先上升镜筒，把油镜头移开，与高倍镜平齐呈“八”字形，用擦镜纸沾二甲苯少许把油镜头上的香柏油擦拭干净，用绸布包好，送回镜箱。 4．使用显微镜注意事项： (1)取送显微镜时，不可单手斜提，前后摆动，以防部件滑脱着地损坏。 (2)下降镜筒不宜用力过猛，速度过快，以免压碎玻片标本，碰碎镜头。 (3)使用油镜头或观察液体标本时，显微镜不宜倾斜，以防液体及标本流出。 (4)不可随意取出目镜，以免灰尘落人镜筒，更不能拆卸任何部位的零件。 三、显微镜的使用练习及细胞形态观察： 1．纤维片：取一张纤维交叉片，先用低倍镜观察，将玻片标本前、后、左、右慢慢移动找到交叉点，然后移至视野中央，转高倍镜观察，判断红绿纤维的上下位置。 2．蛙血涂片：取制作好的蛙血涂片，置低倍镜下观察，选择色泽清楚，细胞不重叠部分换高倍镜观察，可见蛙红细胞呈椭圆形，中央有一染成兰色的细胞核，细胞质为粉红色。视野内有时可见到圆形的白细胞，其核的形状不规则(照片1)。 3．神经节细胞：猫脊神经节是脊髓两侧脊神经背根上的一个膨大结构，内含许多神经元 的胞体和平行排列的神经纤维束(照片2)。 取猫脊神经节横切片，置低倍镜下观察，可见视野内有许多大小不等的卵圆形细胞。转 换高倍镜下观察，每个细胞的外围有一层结缔组织的被束，被束内为细胞膜，但细胞膜界限 不明显。中间大而圆的是细胞核，可见1—3个核仁。细胞膜与细胞核之间的均质部分为细 胞质，被束与胞体之间可见到一些卫星细胞，核小呈圆形。 4。小肠上皮细胞：取小肠上皮横切片，置低倍镜下观察，可见小肠腔周围有许多指状的 突起，即为绒毛。选择一根典型的绒毛移至视野中央转换高倍镜观察，小肠上皮为单层柱状 上皮，由大量的柱状细胞和一些杯状细胞组成。柱状细胞呈长柱状，核呈椭圆形染色较深。 杯状细胞镶嵌在柱状上皮细胞之间，形如高脚酒杯，杯口向着游离面，细胞核位于基底部附 近。细胞质中有一个卵圆形的空腔，其中充满粘液从杯口分泌到细胞表面，对小肠上皮起保护作用(照片3)。 作业与思考题 一、作业： 1．填写普通光学显微镜各部件的结构名称。 二、思考题： 1．怎样区别低倍镜、高倍镜和油镜? 2．为什么在使用高倍镜、油镜时仍要从低倍镜开始? 3．当视野出现窗柜或窗外景物时怎么办? 4．经过哪些步聚才能在低倍镜下找到物象? 实验二 细胞器及显微测量 目的要求 1．掌握光学显微镜下高尔基体、线粒体、中心体形态结构及分布。 2．学会目镜测微器的使用。 材料用具 1．学生领用：显微镜、猫脊神经节切片、蛙肾脏横切片、蛙血涂片、目镜测微尺、镜台测微尺。 2．实验室公用：中性红染液、詹纳斯绿B染液、牙签、镊子、吸水纸、载玻片、盖玻片。 实验内容 一、录像：细胞的超微结构。 二、细胞器的观察： (一)高尔基体的观察 取猫脊神经节切片，在低倍镜下观察，可见到许多大小不等、被染成黄色的圆形神经节细胞。选择神经节细胞较多的部位，转换高倍镜仔细观察。在高倍镜下，可见到细胞中央有一圆形、空泡状细胞核，有的核内可见有1—2个发亮的呈淡黄色的核仁。在细胞核周围的细胞质中，散布着被染成棕褐色、呈细长弯曲的线状、柱状和网状的结构即是高尔基体(照片4)。 (二)线粒体的观察 1．人口腔上皮细胞线粒体的活体染色及观察。 (1)原理：线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体的呼吸作用来提供的。詹纳斯绿B，(Janus Green B)是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态而呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。中性红则将细胞核染成淡红色。 (2)方法：将清洁的载玻片平放在桌上，然后在载玻片的中央滴1滴中性红染液、1滴詹纳斯绿B染液，漱口后，用牙签粗端刮取口腔粘膜上皮细胞，在载玻片上的染液中轻轻搅匀，染色4—5分钟(注意：染色过程中，染液不能干，快干时，可再加两种染液各1滴)。 (3)观察：盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余染液。高倍镜下，可见在口腔上皮细胞的细胞质中，散在分布一些染成亮绿色的粒状或短棒状颗粒，即为线粒体。 2．蛙肾脏切片线粒体的观察 取蛙肾切片，依次在低、高倍镜下进行观察。注意观察视野中许多圆形或椭圆形的肾小管，在肾小管细胞核的周围有许多大小不等的蓝色颗粒，即线粒体。各细胞中的线粒体，其形态、大小及数目不尽相同(照片5)。 (三)中心体的观察 观察马蛔虫子宫横切片。在低倍镜下，可以看到官腔内有计多处于不同分裂时期的受精卵，外围有一层厚的受精膜(注意不要误以为是受精卵的细胞膜)，膜内为大的围卵腔。寻找其受精卵处于有丝分裂中期的细胞，然后换高倍镜观察。可见细胞两极各有一个被染成深蓝色的圆形粒状小体(由于切片的关系，有的细胞只能在一极看到被染成蓝色的小体或两 极都看不到)，这就是中心体(内有一对中心粒及其周围的致密物质——中心球)。在中心体的周围，隐约可见纤细放射状的星射线。星射线一部分参与形成细胞中的彷锤体(照片6)。 三、显微测量： 在显微镜下测定标本的大小，常用显微测微尺加以测量，显微测微尺一般由目镜测微尺和镜台测微尺组成。如图2—1、2—2所示。 目镜测微是一块放人目镜的标尺，上面刻有50等份的刻度，而每一刻度(小格)的长度是随物镜放大倍数而改变。所以使用前应在所采用的放大部数的物镜下用镜台测微尺加以标定后，才能代表其实际长度。因为镜台测微尺刻度的每格长度是已知的，其标定及测量方法如下： 1．将www.med126.com/yishi/镜台测微尺置于镜台中央，先在低倍镜下找到镜台测微尺的刻度，每一大格为0.1mm；每一小格为0.01mm(即10um)。 2．将镜台测微尺装入目镜筒中，转动目镜筒或移动镜台测微尺，使两标尺刻度平行。 3.转换高倍镜，在视野中使物镜测微尺任一刻度线与目镜测微尺的任一刻度重合为起点，沿两标尺平行方向再找到另一重合刻度线为终点，记录下两重合线这一区段标尺各自的格数，即可算出目镜测微尺每小格的长度。如低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长为50格，相当于镜台测微尺的68格，便可求出目镜测微尺每小格等于13.6um。其换算公式为： 50:68=1:X X=1.36(格) 1.36*10(um)=13.6(um) 4．取下镜台测微尺，换上需要测量的标本，用目镜测微尺的刻度来测量细胞的长度(格数)所得的细胞长度(格数)乘以每刻度的微米数(um)，即为细胞的实际长度。 作业与思考题 一、作业 l、记录4个蛙血红细胞的长短径，并算出其平均值。 二、思考题 1、线粒体活体染色的原理是什么? 2、进行细胞测量时，在低倍镜下标定目镜测微尺的长度，转换高倍镜后是否需要重新标定。为什么? [附录] 詹纳斯绿B染液的配制 将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液(溶解度为5．18％)，加到5m1无水乙醇中，再加1m1中性红水溶液(中性红10mg溶于150ml蒸馏水中)，并用黑纸包好于4C贮藏。 中性红染液的配制 在5m1无水乙醇中，加20—30滴中性红饱和水溶液(中性红溶解度为5.64％)，即为中性红染液。 实验三 细胞的化学成分 目 的 要 求 1、掌握生物大分子在细胞内的存在部位。 2、学习细胞内化学成分的检测方法。 材 料 用 具 1、材料：马铃薯、动物肝糖原切片、洋葱鳞茎、蟾蜍、小鼠。 2、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、火柴、刀片、小烧杯、剪刀、镊子、吸管；吸水纸。 3、试剂：革兰氏碘液、乙醚、95％乙醇、甲基绿-派洛宁染液、2％过氧化氢、5％三氯醋酸液、联苯胺混合液、1％番红溶液、0.1％酸性固绿、0.1％碱性固绿、5％硫酸酮。 实 验 内 容 一、糖类的观察 糖类是有机体生命活动能量的主要来源。 1、淀粉(starch)：淀粉有直链和支链之分，遇碘液显蓝色反应，加热时蓝色消失，冷却时又重新出现。蓝色的产生是由于直链淀粉遇碘形成不稳定的化合物——碘化淀粉之故。 取一片马铃薯徒手切片放在载玻片上，加一滴革兰氏碘液，可见标本立即染成蓝色。盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，可见在多角形的薄壁细胞中，有许多椭圆形蓝色的颗粒，即淀粉粒。 2、糖原(glycogen)：又称动物淀粉，是动物细胞内贮藏能量的多糖类物质。在肝脏中尤为丰富。可用过碘酸雪夫试剂反应(Periodic Acid Schiff reaction，简称PAS反应)进行检测。PAS反应是利用过碘酸将糖原氧化，把葡萄糖分子中2，3碳原子之间连接的键打开，将其上的乙二醇基变为二醛基，醛基与雪夫试剂反应形成紫红色产物。 在光镜下观察肝糖原切片，可见肝细胞略呈多角形，中央有1～2个染成蓝色圆形细胞核。在细胞质中可见许多紫红色的小颗粒，即为肝糖原。 二、细胞内DNA和RNA的显示 1、原理：利用DNA和RNA聚合程度的不同，对碱性染料有不同的亲和力而进行选择性染色。由于甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA有强的亲和力，DNA被染成蓝色或绿色：而派洛宁分子上只有一个相对的正电荷，它仅和聚合程度低的RNA相结合，使RNA染成红色。 2、方法 (1)洋葱表皮细胞DNA、RNA的显示 ①撕取洋葱表皮一小片，置于载玻片上。 ②滴一滴甲基绿-派洛宁染液，药品数据染色30～40分钟。 ③用吸管吸一滴蒸馏水冲洗，立即用吸水纸吸干(因派洛宁易脱色)。 ④盖上盖玻片，镜检可见细胞质和核仁呈淡红色或红色，表示RNA，而核质呈蓝色表示含有DNA。 (2)蟾蜍血涂片DNA、RNA的显示 ①涂片：将蟾蜍用乙醚麻醉后，打开胸腔，剪开心脏。取心脏血做血涂片，室温晾干。 ②固定：将晾干的涂片浸入95％乙醇中固定5分钟，室温晾干。 ③染色和分化：在标本上滴数滴甲基绿-派洛宁染色液，染色5～l0分钟，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去玻片上多余水分(不要吸得过干)。 ④观察：光镜下可见细胞核呈绿色，细胞质呈淡红色。 三、细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示 1．原理：由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在不同的pH溶液中，整个蛋白质所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理抽提掉核酸后，用带负电荷的固绿碱性染液(pH8.2～8.5)染色，使在此pH环境中带正电荷的碱性蛋白质显示出来。 2．方法 (1)取材和涂片：以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放入蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，室温晾干。 (2)固定：将晾干的血涂片做好标记，于95％乙醇中浸泡5分钟，室温晾干。 (3)三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在60℃的三氯醋酸溶液中处理30分钟，清水冲洗(一定要反复冲净玻片上残留的三氯醋酸，这是染色成功的关键)。 (4)染色：取两张三氯醋酸处理过的血涂片分别放入0.1％酸性固绿和0.l％碱性固绿中，分别染色5分钟和15分钟，水冲、晾干、镜检。 3．结果：显微镜下可见经酸性固绿染色的片子因胞质和核仁中有酸性蛋白分布被染成绿色，细胞核未着色；经碱性固绿染色的片子，只有细胞核被染成绿色，这是碱性蛋白分布的部位。 四、细胞内过氧化氢酶的显示 1．原理：在生物体内，细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢。存在于动植物组织中的过氧化氢酶，能使过氧化氢分解，生成水放出氧气，对机体起保护作用。过氧化氢酶系还能把许多胺类氧化为有色化合物。若用联苯胺混合液处理标本，细胞内的 过氧化氢酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物(蓝色为中间产物——联苯胺蓝不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙)，(照片27) 2．方法 (1)马铃薯过氧化氢酶显示；徒手切片，取一薄片置于载玻片上，滴加新配制的2％过氧化氢溶液，可见组织周围立即放出大量气泡，提示植物活组织中有过氧化氢酶存在。若将上述组织放入开水后，再重复上述实验，观察其结果与上面是否一致。 (2)小鼠骨髓细胞过氧化氢酶的显示 ①取小鼠1只，以颈椎错位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨的一端剪断，用注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上，推片，室温晾干。 ②将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒～1分钟。 ③取出涂片，直接放入联苯胺混合液中反应3～6分钟，清水冲洗。 ④放入1％番红水溶液中染1～2分钟，清水冲洗，室温晾干，镜检。 ⑤观察；涂片中可见一些细胞中有蓝色颗粒，为过氧化氢酶所在位置。 (3) 蛙血细胞过氧化氢酶的显示 ①如以上实验制作蛙血涂片，自然晾干。 ②在片中先滴二两滴联苯胺混合染料，用牙签侧面将其摊平，再在染料边缘迅速滴两滴H2O2酶，用牙签轻轻摊平、混匀，静置3-5分钟，清水冲洗，晾干，镜检。 ③观察；涂片中可见一些细胞中有蓝色颗粒，为过氧化氢酶所在位置。 作业与思考题 一、作业：绘制细胞中过氧化氢酶、碱性蛋白和酸性蛋白、DNA和RNA的分布图。 二、思考题：过氧化氢酶、DNA和RNA显示方法的实验原理各是什么? 【附录】 生物绘图的要求及方法 1、绘图基本工具：铅笔(HB、3H)、尺、橡皮、绘图纸等。 2、生物绘图必须真实，绘图前应选择优良的、有代表性的标本，按照实物的形状、各部分比例、位置及毗邻关系进行描绘。 3、绘图需按一定比例，布局整齐美观，大小适中。图的下方注明该图名称。 4、图的注释应从各部分结构作出水平引线，结构名称写于引线末端，书写要整齐。 5、绘图时先用软铅笔轻轻绘出轮廓，修改后再用硬笔以粗细均匀的线条绘出全图。图的明暗和立体感可用细圆点的疏密来表示，必要时可用彩色描出标本的颜色。 实验四 细胞融合 目 的 要 求 了解聚乙醇(PEG)诱导的细胞融合的基本原理，掌握以PEG进行细胞融合的操作方法。 材 料 用 具 1．材料；HeLa细胞或鸡红细胞。 2．器材；显微镜、普通离心机、离心管、水浴箱、吸管、载玻片、盖玻片等。 3．试剂：50％聚乙二醇(MW＝l000)，pH6.0；Hanks液，pH7.4；RPMl1640培养基；0.25％胰蛋白酶；磷酸盐缓冲液(PBS)，0.2％亚甲基蓝液等。 实 验 内 容 一、原理 细胞融合是20世纪60年代细胞学出现的一种新技术，现在已证明不仅是动物和植物的种内、种间或属间的体细胞，甚至动物和植物细胞之间也可相互融合，因此细胞融合技术对于研究不同细胞之间的相互作用，杂种细胞遗传特性的变异，人类及动、植物的基因图谱，以及为设计遗传工程中的基因选择，培育动植物新品种等方面都是相当有用的。目前其应用范围已广及生物学、医学、农业科学的许多分支学科。 细胞融合，就是两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下，受精过程即属这种情况。此外，如肿瘤细胞具有的多核细胞，发炎及坏死部位见到的多核细胞等，都已有大量文献资料证明是由单核细胞融合而成。现在所称的细胞融合一般是指用人工方法使两个或两个以上体细胞合并在一起，它与两个性细胞的结合(受精)不同，性细胞是单倍体，结合形成一种二倍体细胞；而体细胞融合可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大变化。 一般两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，但在特殊融合因子的诱导下，细胞膜发生一定的变化，就可使两个或多个细胞发生融合，形成新的杂种细胞。在细胞融合实验中，采用的融合因子一般可分为三类：病毒，化学品和生物提取物，近年来，发展了一种用高压脉冲引起细胞融合的新颖技术，但常用的融合因子仍为仙台病毒(HVJ)和聚乙二醇，以下介绍PEG诱导细胞融合的原理。 化学融合因子能引起细胞表面膜中磷脂的酰键及极性基团在结构上发生重排。也有人认为是膜内脂肪的羟键活动增加，或者是诱发膜内颗粒积聚，在空气和水的介面上使磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺单层的表面电位显著降低。化学药品作为促融剂的优点是易得、用法简单，还可深入探讨细胞融合的分子机制。PEG浓度在40％～60％，分子量为1000左右均能使细胞融合：目前有取代病毒类促融因子的趋向。 作业与思考题 一、作业：简述细胞融合的基本原理和操作方法。 二、思考题： 1、何为细胞融合，细胞融合的意义何在? 2、通常融合因子有哪几类，影响PEG因素是什么? 【附录】 试剂配制 1、Hanks液 原液甲： NaCI 160g KCl 8g MgS04·7H2O 2g MgCl2·6H2O 2g 溶于800ml蒸馏水，混匀后加入CaCl2(无水)2.8g，加蒸馏水至1000ml。滤纸过滤，加入氯仿2ml，4℃保存。 原液乙： Na2HPO4·12H20 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20.0g 溶于800ml蒸馏水中，滤纸过滤，加入0.5％酚红80ml，再加蒸馏水至1000ml，最后加入防腐剂氯仿2ml，置4℃备用。 工作液： 甲乙两液各1份，重蒸馏水18份，混匀分装包扎好瓶口，经6.81kg(15磅)高压灭菌20～30分钟，然后置4℃保存备用，可用1个月，使用前以5％NaHCO3调节pH7.4。 2、1％酚红液 将1.0g酚红置于研钵中，绶慢滴入0.1mo1／L的NaOH(0.4％)15ml，边加边磨，直至全部溶解，然后加入85ml重蒸馏水，颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用，室温保存。 3、50％PEG溶液(需现配现用) 称取5gPEG(MW=1000)置试管中，在酒精灯上溶化，然后与预热37℃的Hanks液混匀，即成50％PEG溶液，当pH6.0时融合效率最高。 实验五 细胞分裂 目的要求 1.掌握细胞有丝分裂各期特点。 2.熟悉诚数分裂各期染色体变化的特点。 材料用具 学生领用：显微镜、马蛔虫子宫横切片、紫露草花粉母细胞压片。 实验内容 一、录像：蝗虫精母细胞减数分裂。 二、动物细胞有丝分裂的观察。 取马蛔虫子宫横切片，置于低倍镜下观察，可见到马蛔虫子宫腔内有许多近圆形的、处于不同分裂时期的受精卵细胞。在低倍镜下找出前期、中期、后期、末期的细胞，转换成高倍镜仔细观察。细胞有丝分裂各期的特点如下： 1、前期：细胞核膨大，染色质逐渐螺旋化为丝状的染色丝，其后进一步缩短变粗，形成一定形态和数目的染色体(这时的每条染色体由两条染色单体组成，但在光镜下，一般不易看清)，中心粒一分为二，每对中心粒放出星射线，形成星体，两个早体移向细胞两极，核仁、核膜逐渐消失(照片8)。 2、中期：每条染色体的两条染色单体逐渐分开(但着丝粒仍未分离)。全部染体(2n=6)移向细胞中央的赤道面上，形成赤道板。在赤道板的两面有许多纺锤丝连接细胞两极和染色体动粒，但不易观察到，此时染色体形态最典型。极面观的中期细胞染色体排在赤道面上，呈花瓣状(照片6)。 3、后期：着丝粒纵裂为二。这时，每条染色体的两条染色单体己完全分开，由于纺锤丝的牵引，分别向细胞两极移动，形成了数目相等的两约染色体(照片7)。 4、末期：染色体移至细胞两极并解旋为染色质，星体消失，核仁、核膜重新出现，细胞中部的细胞膜内凹、最后横缢，使细胞分裂为—二，形成两个子细胞(照片8)。 三、植物细胞减数分裂的观察 取紫露草花粉母细胞压片，在低倍镜下寻找减数分裂的花粉母细胞，转换高倍镜，对照附后照片9～2l，观察第—次减数分裂和第二次减数分裂各期以及前期I各个分期的细胞： (一)第一次减数分裂 每个初级花粉母细胞经过第——次减数分裂形成两个次级花粉母细胞。减数分裂过程与有丝分裂相似，也可分为前、中、后、末期，不同的是前期1染色体发生了系列的特殊变化： 即同源染色体的联会和交换。 1、前期I：即第一次减数分裂前期。在减数分裂中，以前期I最有特征性，核的变化复杂，依染色体变化，又可分为—下列各期： (1)细线期：减数分裂开始。本期细胞是一些细胞核较大而染色较浅的细胞群核内出现细长的染色丝，绕成一团。在细丝的局部可见到念球状的染色粒，核仁明显(照片9)。 (2)偶线期：本期细胞核更大，同源染色体配对(联会)。起初每对同源染色体在核的同一侧开始配对，另一侧仍散开未配对，这种图象似花朵。配对的结果，染色体由n对变成n个二价体。这时染色体细长，看不清其数目(照片10)。 (3)粗线期：染色体缩短变粗。每个二价体含有4条染色单体，叫四分体。每条染色体的两条染色单体互称为姐妹染色单体。同源染色体的染色单体间互称为非姐妹染色单体。非姐妹染色单体间的交换是在这时期完成，但在形态上难以见到(照片11)。 (4)双线期：本期染色体缩得更短更粗，同源染色体开始分离，但没有完全分开。由于非姐妹染色单体发生局部交换，可看到交叉现象，且交叉逐渐端化(向端部移动)(照片12)。 (5)终变期：染色体极粗短， 并向核的四周移动。交叉端化明显，形成“O”、“V”、“8”等构象。此时染色体最清楚，便于计数。核膜、核仁消失(照片13)。 2、中期I：二价体向细胞中部集中，排列于赤道面上。从赤道面观可见到四分体排成一列(2n=12)；从极面观可见到四分体排在一个平面上(照片14)。 3、后期I：细胞变长，同源染色体受两极纺锤丝的作用，各自分离，即1个四分体分裂成2个二分体。二分体随机地分为两组，各移向细胞两极，染色体数目减半(照片15)。 3、末期I：到达两极的染色体解旋、延长核膜重建，央出现细胞板，形成两个次级花粉母细胞(照片16)。 (二)第二次减数分裂 次级花粉母细胞形成后，经过短暂的间期，染色体不复制，就进入第二次减数分裂。第二次减数分裂仍分为前、中、后、末四期。次级花粉母细胞较小，往往两两相靠近。 1、前期II：每个二分体螺旋、缩短，但着丝粒仍连在一起，核膜消失(这一时期短暂，不易看到，可不必观察)(照片17)。 2、中期II：本期细胞胞质均匀，染色体。二分体排列在赤道面上， 赤道面观可见二分体排成—列在细胞中央，极面观可见二分体象花朵似地排在细胞中央(照片18)。 3、后期II：每个二分体着丝粒分开，形成两个单分体。每一单分体各具有一着丝粒，故可称为染色体，分别移向细胞两极(照片19)。 4、末期II：每个细胞拉长， 中央形成细胞板。一个次级花粉母细胞形成两个小孢子。即一个花粉母细胞经两次分裂形成四个小孢子——四分孢子(照20、21)。 作业与思考题 一、作业：绘制初级精母细胞(2n=4)减数分裂的中期I、后期I、中期II和后期II的模式图。 二、思考题： 1、细胞有丝分裂各期的形态特征是什么? 2、减数分裂各期的主要特征是什么? 验六 兔肾细胞基因基因组DNA的制备 目的要求 了解从动物细胞中提取高分子量基因组DNA的基本方法。 材料用具 1．学生领用：具塞离心管8只、微量加样器1支、毛细吸管2支、培养皿1付、抽提液1瓶、试管架。 2．实验室公用：高速离心机、振荡器、微量加样器、冰酒精、NDP匀浆； 实验内容 一、录像：细胞基因组DNA制备技术。 二、原理：DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物(DNP)后，必须将其蛋白质除去。动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或浓盐溶液，而核糖蛋白则溶于低盐溶液中，利用这一性质将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开分离得到脱氧核蛋白后，再进一步将蛋白质等杂质除去。 去蛋白的方法很多，我们用含辛醇或异戊醇的氯仿震荡核蛋白溶液，使乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质疑胶停留在水相及氯仿中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％冰乙醇将DNA沉淀析出。 三、方法与步骤 (一)材料处理：取兔肾除去血水和结缔组织，称重后切成小块捣碎。加入2倍体积(V／'V)0．1M氯化纳0.05M、PH7.0柠檬酸纳缓冲液(简称缓冲液)于组织捣碎机上打碎1分钟。组织糜于3000转／分离心15分钟，将沉淀物用缓冲液洗涤2次，并用匀浆器研磨洗涤，每次如前离心。最后得到的沉淀物加6倍组织重的10％氯化钠溶液，充分搅匀置冰箱中过液(最好放置24～48小时)。 (二)提取DNP：将冰箱中过夜的半透明粘稠状液体，用滴管吸出，慢慢注入11倍体积的冰蒸馏水内。这时有白色丝状物——核蛋白析出，用玻璃棒搅起，待干后，将沉淀物再8倍组织重的10%氯化钠溶液中，迅速搅拌以加速溶解。再研磨制成DNP匀浆，冰箱保存备用。 (三)提取DNA(去蛋白)：取500ulDNP匀浆加入抽提液600ul，剧烈振荡5分钟左右，6000转／分离心15分钟，使其分层。上层为含有DNA和DNA核蛋白的水相，下面为抽提液的有机溶剂层，变性蛋白凝胶介于两层之间(图6—1)。吸出上层，再用抽提液如前进行脱蛋白，直到界面处不再出现蛋白凝胶为止。最后吸出上清液并将其移入800ul冰乙醇中静置5分钟。以10000转／分离心5分钟，取沉淀物DNA去乙醇备用。 作业与思考题 一、作业：实验报告(包括操作步骤、实验结果与体会)。 二、思考题： 1．哪一步操作是本实验成功的关键，应该如何操作? 2．影响DNA纯度高低主要因素是什么? [附录] 介绍两种较常采用的去蛋白方法：①用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。②苯酚法：用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相中，或存在于中间残留物中，蛋白质变性后停留在酚层内。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA标本 实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳 目的要求 了解DNA电泳的基本原理和方法。 材料用具 1，试剂：电泳液、琼脂糖(上海东海制药厂)、溴酚兰——甘油溶液、溴乙淀、DNA样品 2。器材：电泳槽、电泳仪、高压锅、微量加样器、紫外分析仪。 实验内容 一、录像：DNA的琼脂糖凝胶电泳 二、原理：凝胶电泳是研究核酸、蛋白质等生物大分子的一项重要技术，也是DNA的限制性内切酶切割片段分析、分离、纯化的一种不可缺少的方法。经琼脂糖(agarose)凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中，琼脂糖凝胶电泳技术为DNA分子及其片段的分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。 DNA的电泳原理和蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除此电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小和构象有关。由于DNA分子或DNA片段的分子量存在差别，故电泳后呈现迁移位置的差异。 三、方法与步骤：1．琼脂糖胶液的制备：称取2克琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml电泳液，瓶口扣小烧杯，置于家庭用小型高压锅内，加热冒出大量蒸汽时扣阀，维持8—10分钟，琼脂糖即可全部融化于电泳液中，取出摇匀，即成为2％琼脂糖胶液。 2．凝胶板制备：当琼脂糖胶液温度降至55度左右时加溴化乙锭至终浓度为0.5ug/ml并摇匀，倒人凝胶架板，去除气泡。在室温下放置0.5—1小时，待胶液全部．凝结后，垂直拨出点样梳，此时在胶的一端形成相互隔开的样品槽(又称加样孔)。立即将琼脂糖胶板放人注有电泳液的电泳槽中，以防止琼脂凝胶中水分蒸发而造成裂缝。 3．加样：将10ul的DNA溶液与预先点样于胶皮上的2ul溴酚兰——甘油溶液混匀，用微量加样器将混合后的样品小心地注入样品槽内(混合在样品中的甘油可增加样品液的比重，因此样品可以自然平铺于样品槽中，不易扩散。由于溴酚兰染料的存在，可直接观察到加样的情况，而且染料在电泳过程中可作为指示标志)。 4．电泳：连通电源线，打开电泳仪开关，调节电压100V，电泳时间约20-30分钟。电泳结束，关闭电源，戴上手套，取出凝胶置于紫外分析仪上，可见到橙红色萤光条带，放置时间超过4-6小时后，荧光减弱。因此，初步观察结束后，应立即照像。 作业与思考题 一、作业：简述DNA电泳的基本原理和操作方法。 二、思考题： 1．溴化乙锭与溴酚兰在电泳过程中有什么作用? 2．本次实验操作成败的关键步骤在哪里? [附录] L溴化乙锭染色原理及试剂配制：溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)，溴化乙锭分子可插 入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，它和核酸形成一种荧光络合物，在254nm波长紫外光 照射下，呈现橙黄色的荧光。称取5毫克溴化乙锭，用无离子水溶解，定容到10毫升，取1毫升稀释到1升，最终浓度为0.5微克／毫升。 2．溴酚兰——甘油溶液(0.05％溴酚兰--50％甘油溶液)：先配制0.1％溴酚兰水溶液， 然后取1份0.1％溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成。 | 
