实验二十二  标准曲线的制作及回收试验

【实验目的】

在生物化学与分子生物学实验过程中，常常需要对生物样品中某种物质的含量进行测定。通过制作待测物质在一定测定条件下的标准曲线，可十分方便快捷地进行样品中物质含量的大批量测定。同时，为了了解生物样品中其他物质对测定结果的影响，可通过回收试验来判断。本实验以邻甲苯胺法测定血液样品中葡萄糖含量为例，通过糖标准曲线的制作及回收试验的操作，综合性训练学生掌握标准曲线的制作以及对大批量生物样品中物质含量进行准确测定的技术方法。

【实验原理】

1. 标准曲线的制作原理  配制一系列已知不同浓度的测定物标准溶液，按样品测定同样的方法处理显色，分别测得它们的光密度，再以光密度为纵坐标，浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，所得的曲线即标准曲线。

制作标准曲线的意义在于：①作为较正曲线，从浓度-光密度的直线特性，可判断某一测定方法中化学反应产生的颜色物质是否符合www.med126.com/wszg/或遵守Lambert-Beer定律。②可判断在操作过程中，操作、仪器等误差的大小，从而确定方法的可靠性。③作为工作曲线，在大量进行样品中测定物含量分析时，通常用作计算的基础，即从曲线上可直接找到测定液的光密度所相当的浓度。

2. 回收试验原理  在分光光度测定法中，测定液除含待测物质外，还含有许多非测定成份而与标准液的测定结果不一致。这些成份是否影响显色反应并引起测定误差，可借回收试验来检查。即在待测样品中加入已知浓度的标准物质，再按样品测定的条件和方法进行显色及测定，然后计算所测出的标准物质的含量占加入标准物质量的百分率，这种操作称为回收试验，以回收率(%)表示。

回收率愈接近100%，说明样品中非测定成份对测定结果的影响愈小，结果愈准确可靠。回收率亦可反映干扰物质存在与否、影响程度如何以及这种影响与浓度有无关系；还可检查操作误差和仪器误差。一般认为回收率达到100±5%即较为理想。

3. 血糖含量测定（邻甲苯胺法)原理  葡萄糖在热醋酸溶液中与邻甲苯胺（ortho-toluidine)缩合生成蓝绿色的希夫碱（Schiff base)，其颜色深浅与葡萄糖含量成正比；与同样处理的葡萄糖标准溶液进行分光光度测定（或根据其光密度查标准曲线)，可求得待测血液样品中葡萄糖的含量。正常人血糖含量为3.89~5.56 mmol/L。

4. 临床意义  血糖超过正常最高值，称为高血糖症，常由糖尿病、甲状腺机能亢进、脑垂体前叶机能亢进、肾上腺皮质和髓质机能亢进等疾病引起。血糖低于正常最低值，称为低血糖症，多见于胰岛素分泌过多、肾上腺皮质机能减退、脑垂体前叶机能减退、甲状腺机能减退等。

【实验试剂和器材】

1. 试剂

⑴ 邻甲苯胺试剂：称取硫脲（thiourea，A.R.)2.5 g，溶于冰乙酸（glacial acetic acid，A.R.)750 mL中。将此溶液转移入1 L容量瓶内，加邻甲苯胺（ortho-toluidine)150 mL, 2.4% 硼酸（boric acid)溶液100 mL，再加冰乙酸至1 L刻度，置棕色瓶中，至少可应用两个月。

⑵ 葡萄糖贮存标准液（50mmol/L)：将少量无水葡萄糖（A.R.或C.P.)置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖0.900 g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100 mL容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100 mL刻度。置冰箱中可长期保存。

⑶ 葡萄糖应用标准液（1.25mmol/L)：准确吸取葡萄糖贮存标准液2.5 mL，置100 mL容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液稀释置100 mL刻度。

⑷ 饱和苯甲酸溶液：称取苯甲酸（benzoic acid)2.5 g，加入蒸馏水1 L中，煮沸使溶解，冷后贮存于试剂瓶中。

2. 器材

⑴ 试管及试管架。

⑵ 刻度吸量管。

⑶ 水浴锅。

⑷ 722型分光光度计。

⑸ 方格坐标纸。

【实验步骤】

1. 操作  取洁净干燥的试管8支，编号，按下表操作：

混匀后置沸水浴中加热15分钟。取出，用冷水冷却；用波长630nm进行比色，以空白管校正光密度到零点，读取各管光密度，并记录之。

2. 结果与计算

⑴ 计算：列公式并计算出测定管的葡萄糖含量（选择与测定管光密度值接近的标准管进行计算)，单位为mmol/L。

⑵ 作图：将以上各标准管光密度为纵坐标，相应的各标准管葡萄糖浓度（依次相当于1.25mmol/L，2.5mmol/L，3.75mmol/L，5.0mmol/L，6.25mmol/L)为横坐标，在坐标纸上作图，绘成标准曲线。

⑶ 从标准曲线上查出血清葡萄糖含量，并与计算的结果进行比较。

⑷ 回收率计算：列公式并计算回收管的葡萄糖含量（选择与回收管光密度值较接近的标准管光密度值进行计算)，单位为mmol/L。

回收率(%) = 回收量(mmol/L)/加入量(mmol/L) × 100%

注：回收量(mmol/L)= 回收管葡萄糖含量(mmol/L)－ 测定管葡萄糖(mmol/L)

本实验中加入量为2.5 mmol/L。

【实验注意事项】

1. 在保证取量准确的前提下，所使用的不同规格的吸量管或移液器应尽可能少。

2. 为保证测定值的精确性，可设定平行管并取平均值。

【思考题】

1. 如何制作标准曲线？制作标准曲线时有哪些注意事项？标准曲线的何用途？

2. 为什么要进行回收试验？其原理是什么？

3. 怎样计算回收率？

4. 邻甲苯胺法测定血糖的原理是什么？

5. 血糖的正常值是多少？有何临床意义？