氟苯尼考联合用药对产ESBLs鸡大肠杆菌抗菌活性的
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超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是由质粒介导、主 要由大肠埃希菌和
肺炎克雷伯菌产生的β-内酰胺酶，能水解
青霉素类，第1代、第2代、第3代和部分第4代头孢菌素及
氨曲南，可在菌株间转移或传播[1,2]。近年来，第3代头孢菌素的广泛应用使产ESBLs的细菌不断增加，已成为兽医临床感染的重要病原菌。值得注意的是，产ESBLs菌株不仅对β-内酰胺抗生素耐药，并且也对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、
氯霉素类、
四环素类等多种抗菌药产生耐药性，这就为动物细菌病的治疗提出了新的挑战。氟苯尼考是氯霉素类兽用广谱抗生素，主要用于治疗畜禽及鱼类的细菌性疾病，随着在兽医临床上的广泛使用，畜禽的致病菌尤其是产ESBLs鸡大肠杆菌的耐药现象越来越严重[3,4]。因此，寻找合理的联合用药已成为控制耐药菌尤其是产ESBLs鸡大肠杆菌感染亟待解决的问题。鉴此，就氟苯尼考与几种抗菌药的联合用药进行药物敏感性试验，从而为氟苯尼考复方制剂的研制及临床合理配伍用药控制产ESBLs鸡大肠杆菌感染提供依据。1 材料和方法1．1 材料1．1．1 受试菌株 质控菌株：大肠埃希菌硼ATCC25922，购于中国药品生物制品鉴定所；临床菌株：7株受试大肠杆菌均从山东病
鸡肝脏中分离，河南农业大学药理实验室保存。1．1．2 药物和药敏纸片 氟苯尼考原粉(95%)、黏菌素(90%)、头孢噻呋(95%)、痢菌净(98%)、
磷霉素钠(65%)、
多西环素(95%)、
阿米卡星(65%)，均由河南牧翔动物药业有限公司提供；
头孢噻肟(30μg/片)、
头孢曲松(30μg/片)、氨曲南(30μg/片)、
头孢他啶(30μg/片)、头孢噻肟/克拉维酸(30/1Oμg每片)、头孢他啶/克拉维酸(30/10μg每片)由北京天坛药物生物技术开发公司提供。1．1．3 培养基、试剂 血平板琼脂(郑州安图生物技术有限公司)、麦康凯琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)、M -H 琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)、M -H 肉汤(青岛高科园海博生物技术有限公司)、G-N增菌液(广东环凯微生物科技有限公司)、革兰氏染色液(郑州理利生物工程有限公司)。1．1．4 仪器 SW -CJ-JC型超净工作台、Pyx-DHx型隔水式电热恒温培养箱、手提式压力蒸汽灭菌器、DZF一6050型真空干燥箱、全自动电子分析天平、新飞电冰箱等。1．2 方法1．2．1 菌液制备 将经过鉴定的鸡大肠杆菌分离株接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养16～18h，挑选单个菌落接种于G-N 增菌液中37℃过夜培养，使菌液浓度相当于108cfu／mL。试验时稀释1000倍，使稀释后的菌液浓度为105cfu/mL[5,6]。1．2．2 药物原液的配制[5,6] 用分析天平精确称取适量药物后，无菌操作使其溶于适宜的溶剂，置4℃ 冰箱中保存备用，配制药在1周内用完。1．2．3 ESBLs表型筛选 采用美国国家临床实验室标准委员会(CLSI，M100-S16)推荐的方法，将增菌培养的菌液均匀涂布于M -H 琼脂上，按照标准纸片扩散法的规定进行，于平板上分别贴上头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南药敏片，37℃ 过夜培养之后，如抑菌圈直径满足以下任一条件即可怀疑其为产ESBLs菌株：头孢噻肟≤ 27mm，头孢他啶≤22mm，头孢曲松≤25mm，氨曲南≤27mm。1．2．4 ESBLs的确认试验(双纸片增效法)[7] 采用美国国家临床实验室标准委员会(CLSI，M100-S16)推荐的方法，将疑似产酶的增菌培养的菌液均匀涂布于M -H琼脂板上，将头孢噻肟、头孢噻肟／克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶／克拉维酸药敏片两两对应，分别贴在同一个M -H 琼脂板上，37℃ 过夜孵育之后，当2组药物有任意1组出现加克拉维酸比不加克拉维酸的抑菌圈直径≥5mm时，即确认为产ESBLs。1．2．5 药敏试验用微量液体2倍稀释法，分别测定氟苯尼考单方药物和复方药物对7株大肠杆菌的最小抑菌浓度。试验中，菌液浓度应为105cfu/mL，置于37℃ 恒温培养箱中，18～24h后观察结果，能抑制细菌生长的最小药物浓度为MIC。2 结果与分析2．1 ESBLs的表型筛选试验及确认试验中抑菌圈直径大小鸡大肠杆菌ESBLs的表型筛选、确认试验结果分别见表1、表2。从表1可以看出，头孢噻肟的抑菌圈直径≤27mm 的菌有6株，头孢他啶的抑菌圈直径≤22mm 的菌有7株，头孢曲松的抑菌圈直径≤25mm的菌有5株，氨曲南的抑菌圈直径≤27mm 的菌有6株，故7株菌均可能产ESBLs。从表2可以看出，7株可疑产ESBLs菌株经确认试验检测，药物中加克拉维酸后，抑菌圈直径明显增大。其中有6株菌出现头孢噻肟/克拉维酸的抑菌圈直径比头孢噻肟大5mm，有5株菌出现头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈直径比头孢他啶大于等于5mm。7株可疑产ESBLs菌株均为产ESBLs的阳性菌株。2．2 药敏试验结果单药和复方药物对7株临床分离的产ESBLs鸡大肠杆菌的MIC值见表3。从表3可看出，7株大肠杆菌对多肽类黏菌素显示高度敏感，而对头孢菌素类头孢噻呋耐药率达100%，对氨基糖苷类阿米卡星耐药率达71%，对四环素类多西环素耐药率达57%，对喹啉类痢菌净耐药率达100%，对磷霉素耐药率达57%。说明这7株产ESBLs菌不但对β-内酰胺抗生素耐药，而且显示较高的多重耐药特性。氟苯尼考与黏菌素复配时，虽说以氟苯尼考计抗菌活性显著增强，但是由于单药黏菌素对7株产酶菌抗菌活性均较强，氟苯尼考与黏菌素(1：1)复配时的MIC与单药黏菌素的MIC几乎一样，氟苯尼考与黏菌素(1：2)复配时，可能是黏菌素的用量加倍的缘故，MIC值普遍降低，由此看出，黏菌素单药使用时就可抑制本试验中的7株产ESBLs大肠杆菌。氟苯尼考与头孢噻呋复配，3个比例均没能使抗菌活性增强。氟苯尼考与阿米卡星3个比例复配时，43 的菌株抗菌活性有所提高，其中以1：2的比例复配时MIC值下降程度最大。氟苯尼考与多西环素3个比例复配时，7株菌的MIC值在不同比例下均有不同程度的下降，尤其以1：2比例复配时下降幅度最大。氟苯尼考与痢菌净只有1：2比例复配时，57 的菌株MIC值呈现较小程度下降。氟苯尼考与磷霉素联合用药时，只有2株菌在1：1和1：2的比例复配时MIC有所降低。3 讨论1)本试验中分离的7株鸡大肠杆菌，经检测均产ESBLs，100%的高检出率，说明产ESBLs菌株呈直线上升趋势。近年来，随着第3代动物专用广谱头孢菌素在鸡病防治中的广泛应用以及第3代医用头孢的滥用，导致大肠杆菌耐药现象相当严重，给临床治疗造成较大的困难。这些耐药菌绝大多数产ESBLs，自1983年德国首次发现此酶以来，与之相关的国内外报道日益增多，产ESBLs菌的种类也越来越多，逐渐引起关注。2)分离出的7株产ESBLs鸡大肠杆菌，不仅对头孢噻呋100%耐药，而且对氯霉素类氟苯尼考100%耐药，对氨基糖苷类阿米卡星71 耐药，对四环素类多西环素57%耐药，对喹啉类痢菌净100％耐药，对磷霉素57%耐药。由此可以看出，产ES-BLs菌株不仅对β-内酰胺酶抗生素耐药，而且呈现多重耐药现象。这与胡功政等[7] 相关报道一致。菌株产酶使药物失活是细菌产生耐药性的机制之一，产ESBLs菌株，能够使青霉素或头孢菌素的β-内酰胺环断裂而使β-内酰胺药物失效。但产酶菌同时对多种药物产生的多重耐药性机制，还有待进一步研究。3)氟苯尼考属动物专用的广谱抗生素，为氯霉素的结构同系物，其作用机理及抗菌谱与氯霉素和甲砜霉素相似，氯霉素有严重的致
再生障碍性贫血的不良反应，而氟苯尼考弥补了此种不足。因此，在动物疾病防治上，氟苯尼考替代了氯霉素，在兽医临床发挥着重要的作用[8,9]。近年来，由于抗菌药物的滥用，致使大量耐药菌株产生，氟苯尼考的抗菌作用也逐渐降低，人们不得不去寻找新的解决办法。结合本次试验结果来看，氟苯尼考与6种药物联合用药时，与头孢噻呋复配完全无效，这与理论上是相符的，头孢噻呋是I类速效杀菌剂抗菌药，氟苯尼考是Ⅲ类速效抑菌剂，I类和Ⅲ类合用时Ⅲ类药物可迅速阻断细菌的蛋白质合成，致细菌基本处于静止状态，因此，和I类合用时有导致后者活性减弱的可能，二者不宜合用。而其他几类药均能使一部分菌株的抗菌活性有所提高，均以1：2效果最佳，其中以氟苯尼考与多西环素1：2配伍，7株菌的MlC值下降幅度最大，6种联合用药中这一组合最好，这与苑丽等[10]报道的相一致。原本对氟苯尼考耐药的产ESBLs菌株在联合用药以后，抗菌活性明显提高，从而可以看出，联合用药是一个控制产ESBLs菌感染的有效途径。
