实验二 细菌的染色与形态结构的观察
一、细菌的染色检查法
细菌体积微小、无色半透明，未经染色不易观察其形态和结构，需经染色，显微镜放大后才能清晰可见。
染色方法有单染法和复染法两种。单染法是使用一种染料使细菌着色，常用的有美蓝和复红染色；复染法用两种或两种以上的染料染色，有助于鉴别细菌，故又称鉴别染色法。常用的复染法有革兰染色法和抗酸染色法。
（一)细菌涂片的制作
要进行细菌染色，首先需作涂片，细菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三个步骤。
1．涂片：
(1) 取洁净载玻片1张，在其中央加1滴生理盐水。
(2) 将接种环烧灼灭菌，冷却后自琼脂斜面上取细菌少许，混于生理盐水滴中，涂抹制成直径约1cm大小的均匀悬液，然后将接种环灭菌。制作涂片时所取菌量不宜过多，以免涂抹不均使细菌聚集成团，影响结果观察。若取液体标本(如肉汤培养物、脓液、痰液等)作涂片时，可不加生理盐水而直接取标本涂片。
(3) 接种环的灭菌和取菌法
灭菌：接种环在取菌前后，其金属丝部分必须用火焰烧红灭菌。方法是右手拿接种环。成45°角置火焰中，待金属丝烧红后，斜持接种环将金属柄缓慢通过火焰灭菌。取菌后的接种环必须灭菌后才能置放实验台上。
取菌：用左手拇指与食指中指夹住琼脂斜面管下端，斜面朝上，试管倾斜，用右手转动一下管口棉塞，在近火焰处用右手小指与掌面夹住棉塞并拔出，已拔出的棉塞不可放在实验台上，也不可触及任何物品。试管口用火焰灭菌后，用已灭菌并冷却的接种环伸入培养管中，自斜面上轻轻刮取细菌，取菌后将试管口再次灭菌，塞好棉塞放回原处。
2．干燥：涂片放室温自然干燥，或将标本涂抹面向上，在离火焰半尺高处微微烘干。切忌直接放在火焰上烤干。
3．固定：常用加热固定法。其目的是杀死细菌，使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染液和水冲掉。手执玻片的一端，标本面朝上，来回通过火焰3次，注意温度不可太高，以玻片反面触及皮肤，感觉微烫为宜。
（二)革兰染色法
【原理】
革兰染色法是最常用的细菌鉴别染色法。同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。
革兰染色的原理，主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰阴性菌细胞壁中含有较多类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞脱色，经复染后，染上复染液(复红)的颜色；而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，酒精不易进入菌体脱色，故细胞仍保留初染液(结晶紫)的颜色。
【材料】
1．葡萄球菌和大肠杆菌18～24h混合培养物。
2．革兰染色液。
【方www.med126.com法】
1．制作细菌涂片、干燥、固定。
2．初染：涂片上加结晶紫染液数滴，染色lmin，用水冲去染液，甩干。
3．媒染：加卢戈氏碘液数滴，1min后水洗，甩干。
4．脱色：加95%酒精，频频摇动玻片，直到不再溶下染料为止，约30s，水洗，甩干。
5．复染：加1%复红染液1min，水洗，甩干。
6．用毛坯纸或滤纸轻www.med126.com轻印干，待标本充分干燥后用油镜观察。
【结果】
葡萄球菌经染色后呈紫色，为革兰阳性球菌；大肠杆菌染成红色，为革兰阴性杆菌。
【注意事项】
1．要掌握好染色的时间，尤其是酒精脱色时间，不宜过长或过短。
2．选用18～24h培养物为宜，否则影响染色效果。
（三)抗酸染色法
见结核分枝杆菌。
二、活菌运动的观察
【原理】
许多杆菌与弧菌有鞭毛，具有动力，运动活泼。直接观察细菌动力是鉴别细菌的方法之一，常采用压片法或悬滴法。
【材料】
1．变形杆菌、葡萄球菌肉汤12h培养物。
2．玻片、凹玻片、盖玻片、凡士林、接种环、酒精灯等。
【方法】
1．压片法 用接种环分别取变形杆菌及葡萄球菌菌液置于洁净的玻片中央，在菌液上轻覆以盖玻片(注意勿产生气泡，也勿使菌液外逸) (图2-1)，静置片刻后于高倍镜下观察。
图2-1 压片法 观察细菌动力
2．悬滴法 在凹玻片的凹窝四周涂少许凡士林，用接种环分别取变形杆菌及葡萄球菌菌液置于洁净的盖玻片中央，将凹玻片的凹窝对准盖玻片的菌液处，反扣覆在盖玻片上，微压使二者贴紧后迅速反转，使菌液悬滴于盖玻片下(图2-2)，静置片刻后于高倍镜下观察。
图2-2 悬滴法镜检操作步骤
【结果】
变形杆菌有明显的定向运动，而葡萄球菌没有定向运动。
【注意事项】
1．镜检时需适当降低聚光器或缩小光圈，视野不宜过亮。
2．需仔细辨认鞭毛的运动与布朗分子运动的不同，前者是有方向的位移，而后者则是细菌受环境中液体分子的冲击呈现在原位附近的颤动。
三、细菌形态、结构的观察
（一) 细菌的基本形态(图2-3)
图2-3 细菌的基本形态
1．球菌：葡萄球菌(呈葡萄状排列)、链球菌(呈链状排列)、脑膜炎奈瑟菌(成双排列)。
2．杆菌：大肠杆菌、枯草杆菌。
3．螺形菌：霍乱弧菌。
（二)细菌的特殊结构
图2-4 细菌芽胞形态的示意图
破伤风梭菌具有芽胞，用革兰染色法染色，可见破伤风梭菌为革兰阳性杆菌，菌体末端有一个圆形未着色的芽胞，整个细菌呈鼓槌状。
2．荚膜：观察肺炎链球菌荚膜(Hiss染色法)。
具有荚膜的肺炎链球菌用Hiss染色法染色后，可见菌体呈蓝色，荚膜不着色(图2-5)。
图2-5 肺炎链球菌荚膜形态图2-6 细菌鞭毛的数目及排列
3．鞭毛(图2-6)：观察变形杆菌鞭毛。
变形杆菌经鞭毛染色法染色后，可见菌体周围有纤细的鞭毛。
