第2章  毒 力 岛

20世纪80年代初，Goebel研究发现，泌尿道致病性大肠埃希菌（uropathogenic E.coli，UPEC)α-溶血素（α-hemolysin)基因位于一较大的染色体DNA区域上，称之为“溶血素岛”。该岛仅见于UPEC菌株中，而不存在于非致病性大肠埃希菌中，并且该岛还携带其他毒力基因（如P菌毛的编码基因)。90年代Hacker将该岛命名为“毒力岛或致病岛”（pathogenicityisland)，从此毒力岛成为细菌致病机制研究中的一个新概念。

第一节  毒力岛的概念

1997年，Hacker将毒力岛定义为：一个分子量很大的（＞30kb)、载有多个毒力基因的、不稳定的染色体DNA片段，外缘与tRNA基因和/或插入序列相连，存在于强毒株，在相关菌的弱毒株或无毒株中不存在或仅散在分布。

近年来，相继在大肠埃希菌、耶尔森菌属、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门菌、志贺菌等重要致病菌中发现了约20多个毒力岛（表2-1)。随着研究的深入，毒力岛的定义也有了较大的改变。根据最新研究资料，毒力岛应具有以下特征：

表2-1  部分病原菌的毒力岛

（1)一个相对分子量较大的（20～100kb)的染色体DNA片段。

（2)含有编码细菌毒力的基因簇，其产物多为分泌性蛋白和细胞表面蛋白，如溶血素、菌毛和血红素结合因子，一些毒力岛编码输出毒力因子的分泌系统（如Ⅲ型分泌系统)、信号转导系统和调节系统。

（3)一些毒力岛的两侧常常具有同向重复序列（RS)和插入元件（IS)，但也能没有。

（4)往往位于细菌染色体的tRNA基因位点内或附近，或者位于与噬菌体整合有关的位点，毒力岛的插入位点常与tRNA基因有关。

（5)毒力岛DNA片段的G＋Cmol%、密码使用与宿主菌染色体有明显差异，有的比宿主菌G＋Cmol%明显高，有的低，提示毒力岛是通过基因的水平转移从外界获得的。

（6)是可移动的遗传成分和不稳定的DNA区域，可发生部分或完全缺失。缺失的频率为10^-4～10^-5。

不过，有些毒力岛的某些特征也有例外，如幽门螺杆菌cag毒力岛既不插入在tRNA位点内或其附近，也不位于与噬菌体整合有关的位点。事实上，毒力岛具有很大的异质性。

一种病原菌可以有1个或几个毒力岛，如鼠伤寒沙门菌有5个毒力岛。部分学者认为，毒力岛还应包括位于噬菌体和质粒上与毒力有关的、其G＋Cmol%和密码使用与宿主菌明显不同的DNA片段。

毒力岛不仅赋予病原菌特殊的致病能力，介导感染过程的特殊阶段，而且在细菌进化过程中扮演重要角色，毒力岛的获得可能与新现病原菌密切相关。因此，毒力岛的发现和研究为深入了解细菌的致病性、毒力因子和进化提供了有效的途径。

第二节 大肠埃希菌的毒力岛

一、尿路致病型大肠埃希菌的毒力岛

毒力岛特征  目前，在尿路致病型大肠埃希菌（UPEC)中已发现5个毒力岛（表2-2)。从表2-1和表2-2可见，泌尿道致病性大肠埃希菌的毒力岛具有以下主要特征：

表2-2  泌尿道致病大肠埃希菌的毒力岛及其特点

  *  斜线前为毒力岛的G+Cmol%，斜线后为该毒力岛所在细菌染色体的G+Cmol%

（1)大小为58～170kb；

（2)携带毒力基因簇，能编码α-溶血素Ⅰ/Ⅱ、P相关菌毛（P-related fimbrial，Prf)和Ⅰ型细胞坏死因子；

（3)两侧具有同向重复序列和/或插入序列；

（4)虽然各个毒力岛的细微结构不同，但都位于染色体的tRNA位点内；一些毒力岛上还发现有R质粒和P₄噬菌体的序列；

（5)G＋Cmol%均比宿主菌染色体的低；

（6)含有一些潜在的可移动成分如插入序列、整合酶（intergrase)基因等，可发生缺失；

PaiⅠ和PaiⅡ的比较  如图2-1所示，PaiⅠ和PaiⅡ的两侧分别为16bp和18bp的同向重复序列，其中一个拷贝是tRNA基因3＇端噬菌体附着位点的一部分，不同的是，PaiⅠ的tRNA基因为编码硒代半胱氨酸tRNA的selC基因，紧邻selC-tRNA基因3＇端为一静息(cryptic)的整合酶基因intA；而PaiⅡ的tRNA基因则为编码亮氨酸tRNA的leuX基因，即leuX-tRNA基因是PaiⅡ的插入位点，紧邻该基因的为一静息的P4噬菌体整合酶基因。值得注意的是，leuX-tRNA还可作为调节基因，影响其它毒力相关基因（如Ⅰ型菌毛和鞭毛的编码基因)的表达。以上提示毒力岛PaiⅡ和leuX-tRNA可能共同进化。

UPEC毒力岛可以10^-4的频率从野生株染色体上缺失，使之成为无毒突变株。缺失的机制还不清楚，可能与IS和毒力岛两侧的同向重复序列有关。

图2-1  UPEC 536菌株的毒力岛（PaiⅠ、PaiⅡ)结构示意图

与UPEC 563菌株毒力岛相关的selC-tRNA基因和leuX-tRNA基因的3＇端分别是噬菌体R73和P4整合的附着位点，而与UPECJ96菌株pheV-tRNA基因和pheR-tRNA基因的3＇端则为接合转座子整合到肠致病性大肠埃希菌染色体的靶位点。因此，tRNA基因的3＇端可能通常作为外源DNA整合到细菌基因组的位点。

UPEC 536株的PaiⅠ和PaiⅡ附近分别有静息的噬菌体R73和P4的整合酶基因，并且G＋Cmol%比宿主菌低。因此，推测毒力岛或毒力岛的一部分来源于整合的前噬菌体（或其它可移动的遗传成分)，后者被称为“毒力岛的前体”（Paiprocursor)或“前毒力岛”（pre-Pais)。

另外，毒力岛上还存在与质粒复制起始位点同源的序列、插入元件和“重组热点（Rhs)部分，提示毒力岛的外源性。

二、肠致病性大肠埃希菌和肠出血性大肠埃希菌的毒力岛

肠致病性大肠埃希菌（enteropathogenic E.coli，EPEC)是引起婴幼儿急、慢性腹泻和成人散发腹泻的一类重要病原菌。肠出血性大肠埃希菌（enterophemorrhagicE.coli,EHEC)O157∶H7是一种新发现的病原菌，不仅能引起一般性腹泻，而且能引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征。

LEE毒力岛与AE损伤  EPEC和EHEC在致病过程中都能产生特征性的组织病理学变化—粘附和脱落损伤（attaching andeffacing lesion)，简称AE损伤，其特征为：病菌借助菌毛粘附在宿主肠上皮细胞微绒毛上，并通过宿主细胞的信号转导系统，激活细胞内酪氨酸激酶，致使膜蛋白Hp90的酪氨酸磷酸化，细胞内的肌醇磷酸和Ca²⁺浓度升高。然后，细菌紧密粘附于宿主细胞膜上，引起细胞骨架重排，在细菌粘附处形成致密的纤维样肌动蛋白基座。最后，上皮细胞杯状内陷包绕细菌，细胞的刷状缘脱落并失去微绒毛，上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重的腹泻。

决定AE损伤的基因位于EPEC和EHEC染色体上一个大约35kb的区域，即LEE（locus of enterocyteeffacement)毒力岛。不产生AE损伤的大肠埃希菌中未发现LEE毒力岛。该岛位于染色体82min位置，插入在selC-tRNA处，其G＋Cmol%为39%，明显低于EPEC染色体DNAG＋Cmol%（51%)，其功能为编码Ⅲ型分泌系统和介导AE损伤。与UPEC 536株的毒力岛相比，LEE毒力岛的两侧没有发现重复序列和插入序列，这也可能是LEE较其它毒力岛稳定的原因。

EPEC LEE毒力岛结构与功能  肠致病性大肠埃希菌E2348/69菌株的LEE毒力岛全长35 624bp，预测共有41个开放阅读框, 至少分三个功能区（图2-2)：eae(E. coli attaching and effacing)基因区、esps (E. coli secretedproteins)基因区和escs(E. coli secretion)基因区，可能编码AE病变所必需的全部蛋白，包括（图2-3)：

图2-3  肠致病性大肠埃希菌AE损伤示意图

1．紧密粘附素（intimin) 是由eae 基因编码的一种外膜蛋白，作为粘附因子介导细菌紧密粘附到宿主细胞上，并激活宿主细胞的信号转导系统。

2．Esps  由esps基因编码，目前较为清楚的有4种蛋白，即：①EspA、EspB、EspD：可通过Ⅲ型分泌系统直接移位于被粘附的上皮细胞中，并与EspC（LEE岛外基因转录合成)一起，共同诱导宿主细胞一系列的信号转导；②紧密素易位受体(translocatedintimin receptor，Tir)：Tir由Ⅲ型分泌系统分泌后经转运进入上皮细胞膜，插入到膜蛋白中，然后经磷酸化后，作为intimin在宿主细胞表面的受体，它有三个结构域：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域作为细菌表面的紧密素受体，胞内结构域可诱导聚集的肌动蛋白和其他细胞骨架蛋白集中而产生基质。紧密素与Tir结合，进而诱导不可逆的紧密粘附、肌动蛋白粘连和AE损伤的形成。在这一过程中，宿主的信号转导系统起了重要的作用。

3．Escs  由escs基因编码，至少包括9种蛋白，共同组成Ⅲ型分泌系统，将Esps等毒力因子分泌至细胞外或直接注入宿主细胞以启动信号转导。目前，Ⅲ型分泌系统已成为病原菌致病机制研究的热点之一。在志贺菌、沙门菌、耶尔森菌属中也发现类似的分泌系统。研究发现，在肠致病性大肠埃希菌编码Ⅲ型分泌系统的基因中，约1/3与耶尔森菌属Ⅲ型分泌系统的编码基因及鼠伤寒沙门菌SPI-2毒力岛的ssa基因同源，提示它们有共同的来源或进化上的密切关系。

4．CesD和CesT  分别由cesD和cesT基因编码，为分子伴侣蛋白（chaperone)。

EHEC与EPEC LEE毒力岛的比较  肠出血性大肠埃希菌O157∶H7与肠致病性大肠埃希菌E2348/6www.med126.com9的LEE岛具有相同的特征，但在细微结构上存在差异。EHECO157∶H7菌株LEE岛长43 359bp，包含54个开放阅读框，其中13个位于前噬菌体933L（可能属于P4噬菌体家族)上，该前噬菌体未在EPEC E2348/69株的LEE岛上发现；其余41个开放阅读框为两个岛所共有，大部分基因的同源性超过95%，少数基因则高度变异。高度变异的基因主要是eae、espB、espD、和espA等，所编码的蛋白涉及细菌与宿主细胞相互作用，如参与宿主上皮细胞信号转导、紧密粘附和AE损伤，提示毒力岛上的一些高度保守的重要毒力基因因宿主菌的不同而发生变异，这有利于宿主菌更好地适应宿主环境。

紧密粘附素介导细菌与宿主细胞结合，其变异可能影响大肠埃希菌在小肠的定居位点。用携带EPEC eae基因的质粒互补O157∶H7突变的eae基因，结果EHEC O157∶H7的定居位点发生改变，反之亦然，而且更加明显。EPEC感染宿主细胞时，Tir被转运至宿主细胞，经磷酸化后，呈现于宿主细胞表面，作为intimin的受体，而EHECO157∶H7感染时，虽然Tir也被转位，但并未磷酸化。以上提示EPEC 和EHEC 之间LEE毒力岛上的变异有表型效应。

另外，LEE岛还可能编码调节蛋白，并携带一些有趣的非编码的遗传成分，如LEE岛右端的残余转座酶基因及较大的肠杆菌重复基因间共同序列（ERIC)，前者可能与LEE进入染色体有关，后者可能影响基因的调控。尽管UPEC和EPEC所致疾病不同，但UPEC536株的PaiⅠ和EPEC E2348/69株的LEE毒力岛都准确插入在相同位点，即selC-tRNA基因处，这为tRNA基因的3＇端可能通常作为外源DNA整合到细菌基因组的位点这一假设提供了又一证据。

第三节  耶尔森菌属的毒力岛

耶尔森菌属至少包括11个菌种，其中鼠疫耶氏菌、假结核耶氏菌和小肠结肠炎耶氏菌与人类致病关系较为密切。鼠疫耶氏菌是鼠疫的病原体，主要经鼠蚤传播，历史上曾引起灾难性的鼠疫流行；假结核耶氏菌和小肠结肠炎耶氏菌是经食物和水源传播的致病菌，在人类可引起肠系膜淋巴结炎和肠炎。

同一致病菌的不同菌株对小鼠毒性不同，据此可将该属的致病菌分为强毒株和弱毒株。遗传分析表明，强毒株具有的小鼠毒性特征取决于一个35kb的毒力岛，该岛不存在于弱毒株和无毒株中，故称之为强毒力岛（high pathogenicity island, HPI)。序列分析显示，鼠疫耶氏菌及假结核耶氏菌O1血清型携带的HPI高度保守，而小肠结肠炎耶氏菌所携带的HPI则有明显差异。因此，耶尔森菌属的HPI 可分为2类：Yen-HPI和Yps-HPI（表2-3)。

表2-3  耶尔森菌属毒力岛及其特点

# 斜线前为毒力岛G+Cmol%，斜线后为该毒力岛所在细菌染色体G+Cmol%

一、小肠结肠炎耶氏菌的HPI

小肠结肠炎耶氏菌可分为1A、1B及2～4共6个生物型，其中仅1B生物型为强毒株，低剂量静脉注射可使小鼠死亡（LD₅₀＜10³cfu)，在人类可引起严重或致死性疾病；非1B生物型均为弱毒株，低剂量静脉注射不能使小鼠死亡(LD₅₀＞10⁵cfu)，在人类仅引起轻微的肠道感染。研究发现，YenHPI仅存在于强毒株1B生物型，而不存在于非1B生物型。

结构特点  在小肠结肠炎耶氏菌Ye8081菌株中，Yen HPI全长43 393bp，大致可分为2个区域（图2-4)：

（1)功能核心区：为GC富含区，大小为30.5kb，为Yen HPI和Yps HPI所共有的部分，包括从intB到fyuA共12个基因，编码产物主要参与耶尔森杆菌素的合成、调节和摄取，故称为HPI的“功能核心区”。功能核心区的G＋Cmol%为57.5%，高于该菌染色体其它部分，提示HPI来源于一个G＋Cmol%较高的遗传元件。

图2-4  Yen HPI的结构示意图

（注：→代表ORF的位置和转录方向)

（2)可变区：为AT富含区，大小为12.8kb，包含4个插入序列（IS1328、IS1329、IS1400、IS1222)和另外7个开放阅读框，功能不明，仅知其中3个插入序列编码6种转座酶。

功能  铁是许多致病菌生长不可缺少的微量元素，细菌从宿主体内获取铁的能力是致病成功的关键因素之一。在人体内，铁主要以血红蛋白、肌红蛋白和转铁蛋白（transferrin)等形式存在，细菌不能直接利用，而体液中游离铁的含量在10^-8以内，明显低于细菌正常生长所必需的铁量，因此，细菌必须启动一些有效的铁摄取系统来获得铁以维持其生长与繁殖。

小肠结肠炎耶氏菌强毒株Yen HPI携带与铁摄取有关的基因簇，包括耶尔森杆菌素(yersiniabactin，Ybt)的合成基因（irps)、摄取基因(fyuA)和调节基因(ybtA)，组成耶尔森杆菌素介导铁摄取系统，这是小鼠致死表型表达必不可少的遗传单元。具体地说，在铁缺乏条件下，小肠结肠炎耶氏菌强毒株HPI能合成低分子量的高铁螯合物，即铁载体Ybt，从宿主转铁蛋白分子上夺取铁，然后通过外膜受体（Psn/FyuA)等，将铁转运至菌体内，供细菌生长利用。

也有人提出，HPI编码的铁摄取系统有利于耶尔森菌的最适生存，并不直接与感染和损伤宿主有关，可能并非真正的毒力岛。

稳定性  Yen HPI至少存在4个重复序列（IS1328，IS1329，RS3和RS4)，它们可能与毒力岛的稳定性有关。除了岛的左端15kb，特别是重复序列聚集的区域外，岛的大部分是保守的。YenHPI两端为17bp的同向重复序列DR₁₇，与天冬酰胺tRNA基因asnT-tRNA 3＇端不完全重复，与其紧邻的为一灭活的整合酶基因intB，因阅读框内单个碱基突变（由GAA变成TAA)，导致intB过早出现终止密码子而灭活，故YenHPI似乎比Yps HPI稳定。Yen-HPI 虽可发生不完全缺失，但缺失的频率比Yps HPI低得多。

二、鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌的HPI

结构特点  YpsHPI是存在于鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌O1血清型染色体上的毒力基因簇，内含合成与摄取耶尔森杆菌素的基因及其调节基因，行使铁摄取功能。图2-5为Yps HPI的结构示意图。

图2-5  Yps HPI的结构示意图

（注：→代表ORF的位置和转录方向)

Yps HPI亦由两个区域组成，其中“功能核心区”的基因序列和排列与Yen HPI相同，而fyuA基因下游的AT富含区则与YenHPI完全不同，该区较小，只有5.6kb，仅包含1个插入元件IS100和另外几个功能未明的编码序列。因此，Yps HPI比Yen HPI小，约35kb，不如YenHPI 稳定，可以10^-5的频率发生完全缺失。与Yen HPI不同，Yps HPI可以随意整合在3个asn-tRNA基因的任一处，而且其中的整合酶（int)基因完整，未被终止密码子干扰。

鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌HPI的比较  虽然鼠疫耶氏菌和假结核耶氏菌O1血清型的HPI高度保守，但两者存在一些差异，主要表现为：

（1)HPI在染色体上的定位不同：在鼠疫耶氏菌中，HPI和约为68kb的色素沉积区（pigmentationsegment)紧密连锁，共同组成不稳定的102kb的Pgm位点，假结核耶氏菌O1血清型没有Pgm位点。hms基因编码产物具有聚积血红素（色素沉着)能力，提示鼠疫耶氏菌在蚤类的消化道内聚积大量含铁的血红素。当该菌通过蚤类叮咬进入哺乳动物体内，自身就携带着大量为生长所必需的铁元素，故可在感染的早期即可大量繁殖。

（2)HPI的切除或缺失的结局不同：在鼠疫耶氏菌中，HPI不能发生精确切除，通常是经Pgm位点两侧的IS100之间的同源重组而自发缺失；而在假结核耶氏菌O1血清型中，HPI可被精确切除，很可能是通过HPI两侧17bp的同向重复序列间同源重组。

在鼠疫耶氏菌HPI的一端，还发现了与噬菌体P4和P2蛋白相关的编码序列，这为HPI是通过噬菌体水平转移而获得的假设提供了强有力的证据。此外，有93%肠聚集型大肠埃希菌、27%侵袭型大肠埃希菌、5%肠产毒型大肠埃希菌和肠致病型大肠埃希菌亦携带了HPI毒力岛，提示耶尔森菌属与其它细菌之间可能存在高效的HPI水平转移。事实上，毒力相关基因在不同种属间的水平转移已是司空见惯。可见，深入探讨毒力岛的来源、移动和获得机制，将有助于了解新现病原菌的起源与细菌的进化。

第四节  幽门螺杆菌的毒力岛

幽门螺杆菌（H.pylori，以下简称HP)是引起急慢性胃炎和消化性溃疡的重要病原菌，是胃癌的危险因素之一。对幽门螺杆菌Ⅰ型（cagA^＋、vacA^＋)和Ⅱ型菌株（cagA^－、vacA^＋)的遗传学差异与致病性关系的研究发现，Ⅰ型菌株含有1个约40kb的特殊基因片段，具有毒力岛的典型特征，称之为cag毒力岛，它负责编码细胞毒素相关蛋白（cytotoxin-associatedprotein，CagA)等毒力因子。CagA是Hp表面的免疫蛋白，与胃和十二指肠疾病的进展有关，例如，从消化性溃疡和肠型胃癌患者中分离的Hp菌株大部分携带cagA基因（cytotoxin-associatedgene A)，而从无症状的Hp感染者中分离的菌株则缺乏该基因。在西方国家，大约50%～70%的Hp临床分离株携带该基因。因此，对cag毒力岛的分析有助于了解Hp的致病机制。

一、cag毒力岛的结构

cag毒力岛具有以下结构特点：

（1)存在于致病菌株，弱毒株或无毒株中不存在或很少见。5%～10%的Hp菌株可发生cag毒力岛的部分缺失。

（2)含有编码细菌毒力的基因簇。cag毒力岛由2个部分组成（图2-6)，即上游的cagⅡ区，包含14个基因（亦有学者认为有15个基因)；下游的cagⅠ区，包含16个基因。多数Hp菌株中的cag毒力岛呈连续状态存在，而在部分Hp菌株中，cagⅡ区和cagⅠ区被插入序列IS605隔开。

（3)cag毒力岛的两侧为31bp的同向重复序列，在cagA^－菌株的染色体上也存在一个同样的拷贝。有的Hp菌株含有IS605，它编码与基因重排有关的转座酶（transposase，Tnp)A和B。tnpA与大肠埃希菌tnp基因IS200核心序列明显相似，tnpB与嗜热细菌PS3中tnp基因同源性也甚高，提示cag毒力岛的获得或丢失可能通过由同向重复序列参与的位点特异性重组或普遍性重组而实现。

（4)cag毒力岛并未插入在任何tRNA基因处，离最近的tRNA基因也相差数个kb，而是插入在染色体上的谷氨酸消旋酶(glutamatase racemase) 基因中。因此，cag毒力岛可能是Hp在进化过程中一次性获得的。如果cag毒力岛为可移动的元件，那么这一独特定位提示其插入机制与其它已知的毒力岛不同。

（5)G＋C mol%平均为35%，低于Hp染色体DNA平均G＋C mol%（38%～45%)，提示cag毒力岛可能是从外界获得的。

图2-6  幽门螺杆菌cag毒力岛的结构示意图

二、cag毒力岛的功能

计算机分析显示，cag毒力岛的编码产物与蛋白酶、转座酶、传感器、透性酶、菌毛和鞭毛装配蛋白及分泌相关蛋白存在一定的同源性。cag毒力岛所携带的一些基因与编码Ⅳ型分泌系统的基因存在同源性，提示cag毒力岛编码的蛋白主要起泵出大分子的功能，涉及细菌与宿主细胞的相互作用。

cag毒力岛可能通过蛋白的分泌、转位来干扰宿主的信号转导，使宿主蛋白磷酸化、细胞骨架重排。研究发现，幽门螺杆菌通过Ⅳ型分泌系统，将CagA蛋白转运至胃粘膜上皮细胞中，CagA蛋白被酪氨酸磷酸化后，可诱导处于酪氨酸磷酸化状态的各种细胞蛋白的改变，这一发现为人们认识Hp与宿主细胞之间相互作用提供了新的途径。

cag毒力岛编码的外膜蛋白中至少有6种可激活核转录因子-κB（NF-κB)，从而增强炎症细胞因子如IL-8的表达，引起严重的炎症反应。在cagⅡ区，发现4个VirB基因和1个VirD基因的同源序列，其编码产物与许多原核细胞起分泌功能的蛋白质相似，包括Ⅳ型分泌系统，参与物质转运出细胞外膜或在细菌表面的表达。这些基因的突变或缺失会降低Hp介导上皮细胞产生IL-8的能力。因此，该分泌系统可能转运1种或多种能刺激上皮细胞产生IL-8的因子。

另外，如果cag毒力岛的一些基因发生突变或缺失，Hp会丧失或减低破坏上皮细胞基底层及细胞骨架的能力，同时该菌在体外生长的能力亦受影响。

可见，cag毒力岛所编码的蛋白（或酶)的功能可能包括：①介导Hp与宿主细胞粘附；②诱导宿主细胞信号转导；③构成分泌系统，将细菌蛋白质（或酶)转运至宿主细胞中。

Hp是一个极易变异的细菌，菌株之间的遗传差异决定感染的临床结局。具有cag毒力岛的菌株与胃炎和胃癌的关系更为密切。感染携带cag毒力岛的菌株，其临床结局可能较为严重。因此，应对cag毒力岛在Hp的定居、持续感染和致病中的作用加以深入研究。

三、cag毒力岛与细菌进化

cag毒力岛的获得及随后的染色体重排在Hp的进化中起重要作用。cag毒力岛两端具有重复序列和插入元件，提示可能由水平转移的方式获得，经基因重组，将完整的cag毒力岛插入染色体的谷氨酸消旋酶基因(glr)3＇端。幽门螺杆菌获得cag毒力岛后，在该岛二侧31bp重复序列和插入序列IS605的参与下，进行染色体重排，导致多种中间菌型的产生。研究发现，33%Hp菌株含有一个8.1kb的质粒，其G＋Cmol%与cag毒力岛非常接近，提示Hp可能通过以质粒为基础的水平转移获取毒力岛，并通过基因重排，推动其进化。

cag毒力岛的获得可促使空泡/细胞毒素vacA基因的进化。vacA基因在Ⅰ型和Ⅱ型菌株中都存在，但在Ⅱ型菌株中可能不表达，说明vacA的表达与cagA存在紧密的联系。含有cag毒力岛的Ⅰ型菌株毒力增强，而缺乏cag毒力岛的Ⅱ型菌株毒力减弱。有人推测，VacA的活性可能是在一个尚未发现的、与cag毒力岛有关的另一个毒力岛编码的分泌器装置的控制之下。

总之，深入探讨cag毒力岛与细菌在胃粘膜上的定居、停留和致病的关系，cag毒力岛在不同人群中的流行情况，cag毒力岛缺失程度与致病的关系等问题，将有助于揭示幽门螺杆菌的致病机制。

第五节  霍乱弧菌的毒力岛

霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌。根据菌体（O)抗原不同，目前可将该菌分为200多个血清群，但只有O1群古典生物型（classicalbiotype)、埃尔托生物型（EI Tor biotype)和O139群霍乱弧菌能引起霍乱暴发流行。研究表明，古典生物型、埃尔托生物型、O139群霍乱弧菌之所以能成为病原菌，原因在于这些菌株染色体基因组上携带CTX毒力单元，能产生霍乱肠毒素，并携带毒力岛VPI（V.choleraepathogenity island)。

结构特点  VPI毒力岛大小为39.5kb，含整合酶和转座酶基因，两侧分别为20bp的att附着位点，插入在10SrRNA基因（ssrA)附近，主要包含aldA基因、tagA～D基因簇、TCP基因簇和ACF基因簇（图2-7)。VPI毒力岛G＋Cmol%为35%，明显低于细菌染色体DNA的G＋C mol%（47%～49%)。

编码产物及其功能  主要编码毒素协同调节菌毛（toxincoregulated pilus，Tcp)和辅助定居因子（accessory colonization factor，Acf)等毒力因子（表2-4)。

表2-4  霍乱弧菌毒力岛上基因及其编码产物

toxT位于TCP基因簇中tcpF 和tcpJ之间，编码蛋白ToxT能调控一些基因（包括tcpA、tcpC、tcpI、ctxAB、ACF基因簇、aldA)的表达

VPI毒力岛与细菌进化  VPI毒力岛可以丝状噬菌体的形式存在，该噬菌体称为VPIф，其基因组为单链DNA，在宿主细胞内可以双链的质粒复制形式存在。TcpA亚单位可作为VPIф的衣壳蛋白。VPIф可感染无CTX毒力单元和VPI毒力岛的霍乱弧菌，并整合到染色体基因组上，使之成为病原菌。研究表明，并非所有携带VPI毒力岛的霍乱弧菌均可被诱导出VPIф，也不是所有不携带VPI毒力岛的霍乱弧菌均可感染VPIф，原因不清。

霍乱弧菌染色体基因组上的CTX毒力单元，也可以质粒形式存在，亦可形成噬菌体分泌到菌体外，该噬菌体简称为CTXφ。CTXφ可在霍乱弧菌间水平转移，即以VPI毒力岛合成的Tcp菌毛为受体，感染无CTX毒力单元但携带VPI毒力岛的霍乱弧菌，并通过attRS位点整合到受体菌的染色体上，从而形成新的霍乱产毒株。

1996年印度出现的霍乱弧菌O139菌株是一种新的流行株，携带两种不同的CTXφ基因组并串联整合在染色体上：一种是以前出现在埃尔托生物型菌株中的CTX^ETφ；另一种是新发现的CTX^Calcφ。这两种噬菌体均能将ctxAB基因转移到非产毒株中。

第六节  毒力岛在细菌进化中的意义

一、毒力岛的获得与细菌毒力的进化

点突变、基因的水平转移和基因重组是细菌进化的主要推动力。但点突变仅导致“缓慢”进化，而较大基因片段的获得与缺失则可使细菌基因迅速发生遗传上“量的飞跃”（quantum leap)。噬菌体、质粒、转座子和毒力岛参与了这些快速进化过程，基因转移途径包括裸露DNA的转化、噬菌体转导、质粒介导的接合转移等，从而产生新的变异菌株，如新现致病菌O139群霍乱弧菌、肠出血性大肠埃希菌O157∶H7等。

噬菌体、质粒和转座子是可移动的遗传元件，可编码细菌毒力因子，例如，志贺样毒素、霍乱肠毒素、白喉毒素和肉毒毒素由噬菌体编码；一些革兰阴性致病菌（如福氏志贺菌、沙门菌和耶尔森菌)及革兰阳性菌（如破伤风梭菌)的重要毒力因子由质粒编码；大肠埃希菌的耐热肠毒素基因是转座子的一部分。这些毒力因子随着其载体移动，决定着宿主菌的致病性，因此，质粒、噬菌体或转座子的水平转移可能与新现病原菌的产生有关。

毒力岛在细菌毒力的进化中扮演更为重要的角色，主要证据有：①毒力岛存在于众多细菌中；②毒力岛的结构特点决定了DNA重组的可能性，可能在新病原菌产生的过程中发挥作用。例如，O139群霍乱弧菌的出现与获得VPI毒力岛有关，E.coliO157:H7亦获得一个编码Ⅲ型分泌系统和效应蛋白的毒力岛；③毒力岛与质粒和噬菌体关系密切，主要表现为：毒力岛所携带的基因也存在于噬菌体和质粒上（后两者称为前毒力岛)；具有与噬菌体和质粒相似的特征，这一现象在链霉菌中较常见，可能是染色体以外的遗传成分共整合的反映；④某些致病菌具有较高的基因突变率和重组效率，可能为毒力岛的产生与获得提供条件。例如，流感嗜血杆菌和假单胞链球菌中，固有的遗传潜能、高频率的突变和重组是其产生新型致病菌株的前提。一些肠道致病菌包括鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌，指导DNA修复的muts基因常为缺陷型。鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌中存在多个毒力岛亦支持这一观点。

毒力岛的发现丰富了细菌进化理论，但毒力岛的获得能否使细菌成为致病菌，仍取决于多个因素，如毒力岛基因、受体菌的状态和被感染宿主的特征。有些基因（如霍乱肠毒素基因、LEE毒力岛)的获得足以使细菌成为致病菌。细菌毒力进化还与宿主细胞的选择压力有关。

噬菌体、质粒或毒力岛转移至新的宿主菌后，有二个遗传过程最为重要，即新获得的基因元件的稳定性和最优化表达。细菌获得毒力岛后，常会发生一些突变，在毒力岛上可移动的基因中出现终止密码子，如Yen HPI中编码整合酶的intB基因，因其起始密码子后第415位碱基发生突变，由G变成T，出现终止密码子TAA，从而被灭活，这可能是新现致病菌的遗传稳定过程，目的在于避免丢失新基因，使优势基因保守。另外，如果毒力岛的特异性基因不能接受宿主菌调节网络的协调控制，那么这些基因将不能恰当表达。例如，产单核细胞李氏菌的毒力岛虽然存在于染色体上，但因prf调节基因启动子区异常而不能正常表达。

有趣的是，毒力岛不仅携带结构基因，而且携带调节元件，如小肠结肠炎耶氏菌HPI的ybtA调节子和霍乱弧菌毒力岛的toxT基因，这可能对建立毒力岛与宿主菌调节网络之间的协调作用大有裨益。

二、tRNA位点和毒力岛的其它边缘序列

毒力岛的边缘通常为tRNA基因位点、同向重复序列或插入元件，其中，同向重复序列可能作为特异性重组的靶位点，并促进重排；插入元件在毒力岛的切除和整合中起一定执业兽医的作用。

许多毒力岛位于tRNA基因附近，如UPEC和EPEC的毒力岛编码完全不同的毒力因子，但都插入在selC-tRNA基因的相同碱基处，这一现象强烈提示特异性基因重组导致毒力岛的整合。事实上，在许多细菌如大肠埃希菌、假单胞菌，甚至是真核细胞中，tRNA基因是外源DNA和噬菌体整合到染色体的靶位，许多噬菌体还携带tRNA基因特异性序列。此外，tRNA也参与不同基因的表达, 提示该位点可能在毒力岛和噬菌体特异基因的调节中另有作用。因此，tRNA基因可作为基因组中外源遗传单位和调节元件的标记。

虽然毒力岛获得的机制还不是很清楚，但许多毒力岛的特征符合经噬菌体整合酶将其整合入靶位点的模型。整合酶可由可移动的DNA元件，如接合性质粒或噬菌体所编码。噬菌体通过位点特异性重组整合在其靶DNA附着位点。tRNA基因的3＇端通常作为附着位点，这一现象被认为具有进化优势。因为细菌的tRNA基因不仅保守，而且过剩，其3＇端的重组仍保留了tRNA的功能。

位点特异性重组具有二个主要特征：①插入DNA片段的两侧为同向重复；②整合酶基因插入在tRNA基因附近。毒力岛与tRNA基因的密切联系表明：tRNA位点在致病菌进化中起着关键作用。

三、毒力岛的缺失与细菌对环境的适应性

从进化的观点来看，毒力岛的获得和缺失都是基因组可塑性或弹性（plasticity)的重要原则。有的细菌或真菌在特定条件下，为适应新的环境并朝着更有利的生存方式发展，也可能丢失原有的毒力岛。例如，在链霉菌中，有一大至800kb的DNA缺失，缺失部分的两侧通常为完全或不完全重复序列，后者可能在异常重组中起作用。链霉菌基因缺失变异株比野生株适应环境的能力可能更强。

在其它细菌如枯草芽胞杆菌中，存在干扰编码区的DNA片段的缺失。枯草杆菌基因组中42kb片段的缺失，干扰了孢子形成（spo)基因, 并使后者发生融合，产生具有功能和活性的孢子形成决定子，这是一个很好的“进化性”缺失的例子。另外，链霉菌、福氏志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌中也存在染色体上质粒的整合和切除。由此推测，致病菌毒力岛或其它基因片段的位点特异性切除或随后的缺失，可能在细菌适应外界环境方面起一定的作用。某些毒力岛缺失的频率为10^-5～10^-4证实了这一点。

第七节  如何发现新的毒力岛

通过分子流行病学研究鉴定致病菌的新变异株，是检测新毒力岛的基础。首先采用传统的流行病学原理和方法，确定研究现场和研究对象，采集标本分离相关菌株，然后利用分子生物学原理和技术，如基因序列分析、分子进化分析和单链构象多态性，检测和鉴定新的遗传变异株。

依据毒力岛的结构和功能特征，识别和鉴定细菌未知毒力基因，是发现未知毒力岛的基本方法。目前，已有很多方法用于毒力岛的研究，其基本思路主要有正向和反向二种方式：

（1)正向方式：表现为从结构到功能，是从比较基因组的角度出发，首先用常规方法鉴定新病原菌，然后根据其毒力特征，将其基因组与相关细菌的基因组进行比较，找出特异的基因成分，最后分析它是否与细菌的毒力性质相关，并证实其功能。

（2)反向方式：表现为从功能到结构，是在对现有毒力岛和其他毒力因子了解的基础上，采用转座子插入、定向缺失等技术，灭活致病菌染色体上某些基因成分，观察细菌毒力特性的改变，找出灭活基因和毒力丧失之间的关系，利用分子生物学手段得到该段毒力相关基因，分析是否具有已知毒力岛的特点。再依据分子Koch原则，将灭活基因恢复正常状态，如细菌毒力同时得以恢复，则认为这段毒力相关基因是一个毒力岛。

常用的鉴定细菌未知毒力基因的的方法有条码标记法（signature tagging)、减法杂交(subtraction hybridization)、特征性差异分析（representationaldifference analysis)、mRNA功能分析（differential display of mRNA)、比较基因组作图（comparativegenome mapping)、接合介导的DNA插入取代标记法（conjugation- mediated direted tagged internalDNA replacement)、粘粒克隆测序（cosmid cloning combined with sample sequence)、毒力岛探查法（islandprobing)等。这些新技术的应用，已成功地发现了一些毒力岛，如沙门菌中第2个毒力岛、幽门螺杆菌的cag毒力岛和牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)的毒力岛。

但是，细菌种类繁多，基因组成复杂多变，弄清细菌未知的毒力岛，还缺乏一个通用易行的有效方法。这就需要我们根据毒力岛本身的一些特点，利用已掌握的毒力岛知识和分子生物学新方法，主动地寻找未知的毒力岛。

总之，毒力岛的发现使我们对细菌的致病性和进化方式有了新的认识。过去，人们往往认为细菌的毒力是单因素的，即某一毒力因子发挥决定性的作用，事实上，细菌在与宿主进行生存竞争的进化过程中形成的毒力具有非常复杂的特点。毒力岛普遍存在于病原菌中，并可能发生水平转移，只需一个单一的遗传重组的步骤就可能使一个非致病菌变成致病菌。对毒力岛的深入研究，有助于加深我们对复杂微生物世界的认识，对新现病原菌产生的基础及进化机制作出新的解释，阐明病原菌的致病机制及其与宿主细胞的相互作用，并推测与毒力岛相似的遗传元件（如分泌岛、耐药岛、代谢岛)的功能，最终将为人类预防和控制感染性疾病提供理论依据。

 （张冬梅 安徽医科大学卫生管理学院)