免疫细胞化学在细菌学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。细胞都各自有其特异性抗原,应用特异性抗体的荧光素或酶标记物,可以鉴定任何一种细菌。已经成功地用于鉴定几乎所有致病菌的纯培养。尤其是应用免疫荧光技术具有较其他血清学方法简便、快速和敏感等优点,并能直接进行细菌形态观察。可用于鉴定的材料也比较多样,如培养物、感染组织、病人分泌排泄物,外环境中采集材料(土壤、水、杂物等)。由于此法对某些传染病原能较常规方法作出更快速的诊断,因而具有特殊意义。
免疫细胞化学方法用于研究细菌抗原结构和形态学观察,由于单克隆抗体的应用,比其他方法更为有效。
图16-1 免疫荧光在病原细菌诊断程序中的应用时机
从患者咽部粘膜用棉拭子取标本,作涂片用甲组溶血性链球菌荧光抗体染色,能够很快作出诊断。对于痢疾杆菌、霍乱孤菌、布氏杆菌、炭疽杆菌和脑膜炎双球菌、肺炎双球菌等的实验诊断均有较好的效果(如表16-1)。
利用间接免疫荧光或酶标记抗体法,检测患者血清中的抗体更有价值,广泛用于临床诊断和流行病学研究。
表16-1 免疫荧光细胞化学方法在细菌诊断中的应用评价
菌种 | 疾病 | 标本 | 方法 | 敏感性 | 特异性 | 意义 |
甲组链球菌 | 急性咽峡炎 猩红热 | 咽部培养物 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
急性风湿热 | ||||||
乙组链球菌 | 新生儿败血症 | 阴道拭子 | DIF | 高 | 中 | 快速 |
脑膜炎 | 临床标本 | 鉴定 | ||||
牛型乳腺炎 | 培养物 | |||||
致病性大肠杆菌 | 婴儿腹泻 | 大便 | DIF | 高 | 中 | 过筛 |
杆菌 | ||||||
伤寒沙门氏菌 | 肠伤寒 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
沙门氏菌 | 肠炎 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
(大多数血清型) | 肠热脑膜炎 | 食品 | 过筛 | |||
环境标本 | ||||||
培养物 | ||||||
志贺氏菌属 | ||||||
宋内氏菌 | 菌痢 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
福氏菌 | 菌痢 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
百日咳杆菌 | 百日咳 | 鼻咽涂片 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
流感嗜血杆菌 | 细菌性脑膜炎 | 脑脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
肺炎球菌 | 细菌性脑膜炎 | 脑脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
脑膜炎球菌 | 细菌性脑膜炎 | 脑脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快诊 |
出血点 | (差) | |||||
军团菌病 | 小叶肺炎 | 痰,肺渗出物 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
肺组织切片 | IIF | 快诊 | ||||
李氏菌 | 李氏单核细胞 | 体液涂片 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
增多症 | 组织切片 | |||||
布氏杆菌 | 布氏症 | 胎盘 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
(牛、羊、猪型) | (人、畜) | 病理组织培养物 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
结核杆菌 | 结核病 | 痰及其消化液 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
胎儿孤菌 | 孤菌病 | 子宫阴道粘液 | DIF | 高 | 中 | 诊断 |
类丹毒菌 | 动物感染 | 血液、组织、培养物 | DIF | 较高 | 高 | 诊断 |
放线菌 | 放线菌病 | 扁桃腺病理排泄物 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
钩端螺旋体 | 钩体病 | 尿沉渣,新鲜组织刮片或切片培养物 | DIF | 中 | 高 | 诊断 |
奈瑟氏淋球菌 | 淋病 | 结膜、皮肤破损,关节 液 | DIF | 较高 | 中 | 过筛 |
绿脓杆菌 | 肺炎 | 病理组织 | DIF | 较高 | 中 | 诊断 |
类鼻疽杆菌 | 类鼻疽 | 排泄物 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
病理组织 | DIF | 中 | 高 | 诊断 | ||
马疽杆菌 | 鼻疽 | 排泄物 | DIF | 高 | 高 | 早诊 |
病理组织 | ||||||
脆弱类杆菌 | 败血症 | 血及其他有关临床标本 | DIF | 高 | 较高 | 诊断 |
黑色素源标菌 | 牙周病物 | 病变部位分泌物 | DIF | 高 | 高 | 辅诊 |
脏器脓肿 | ||||||
梭状芽胞杆 | 肉毒中毒 | 食物 | DIF | |||
菌属 | 动物黑腿病 | |||||
变部组织 | ||||||
羊炭疽 | 大便等 | DIF | 高 | 较高 | 辅诊或诊断 | |
气性坏疽 | ||||||
破伤风 | ||||||
结肠炎等 | ||||||
沙眼衣原体 | 沙眼 | 结膜刮片 | DIF | 高 | 高 | 诊断 |
(引自,黄策:免疫荧光和荧光免疫。1983)
(一)试剂制备
用抗甲组溶血性链球菌的抗体,以FITC标记,制成荧光抗体,再用C和G链球菌充分吸收;或用抗I型链球菌M蛋白成分的血清,标记后吸收,都有可靠的特异性。
(二)检查方法
(1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜,取标本。
(2)将拭子浸入1ml肉汤小试管内,37℃培养2~3h。
(3)取出棉拭了作分离培养,常规鉴定。将肉汤液离心3~4min,3000r/min,弃上清,沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗涤,再离心沉淀,弃上清。
(4)以沉淀涂片,直径约1cm,涂两个圆形区。
(5)将标本www.med126.com/yishi/放入95%酒精中固定1min,然后浸入PBS中洗1次,取出室温晾干。
(6)直接法染色,左侧标本作对照,加非溶血性链球菌荧光抗体染色。右侧加甲组溶血性链球菌荧光抗体染色。置湿盒中孵育20~30min,再用PBS洗2次,每次5min,振动洗涤,滤纸吸干标本周围的水。
(7)加缓冲甘油封裱,立即荧光显微镜观察。
免疫荧光检出的阳性率较培养法为高,因为前者可以检出抗菌素治疗后的死菌。二者符合率达95%。
(一)制备荧光抗体
可用多价和I、II、III、IV型单价的脑膜炎球菌抗血清,分别制备多价和单价荧光抗体。
(二)检查方法
用患者咽拭子,脑脊液或培养标本制备涂片,晾干,火焰或乙醇固定,37℃中染色30min,荧光显微镜检查。
抗脑膜炎双球菌的荧光抗体有很高的特异性,可以快速检出和鉴定脑膜炎双球菌。有人应用免疫荧光检查267例脑膜炎病人脑脊液中脑膜炎双球菌,阳性率73.4%,培养和普通染色则只分别为41.9%和34.4%。
霍乱和副霍乱是严重的传染病,快速诊断才能及早防治。取病人粪便标本直接涂片荧光抗体染色检查,与常规培养法比较,具有快速特异和检出率很高的优点。尤其适用于急性期病人的诊断。
鼠疫是烈性传染病,快速及时的诊断对于控制流行和救治病人有决定性意义,免疫荧光快速诊断方法是一种特异和敏感的手段。直接法和间接都可应用,以直接法更简便。
炭疽也是一种烈性传染病,早期快速诊断对救治病人有决定性意义。免疫荧光检查方法对炭疽杆菌的检出率很高。应用抗夹膜荧光抗体检查炭疽杆菌有十分确定的诊断意义。也可用间接法检测血清中抗夹膜抗体。
(1)制备当地常见的致病性大肠杆菌荧光抗体。
(2)取病人大便标本或直肠拭子以生理盐水搅和涂片,晾干,火焰固定。
(3)直接法免疫荧光染色,立即荧光显微镜检查。
由于本菌较其他非致病性大肠杆菌组有特殊的抗原,不易发生强交叉反应。所以,在儿童肠炎和引起人群暴发性肠炎时更准确、快速和简便。
结核杆菌感染机体后可以诱导产生抗体,可用间接法检查血、胸腹水和脑脊液中的抗体。
也可用抗结核杆菌的荧光抗体直接法检查抗原。
对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断,效果良好。
(1)根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记FITC制成荧光抗体。
(2)检查方法:
①血液标本的检查:取发热期的病人或发病动物的血液约2ml,制取血浆,并加入钾明矾(0.058g/ml),振荡混匀后置室温10~15min,然后中速离心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫荧光染色,镜检。
②尿液标本检查:取病人或动物尿液约2~3ml,高速离心,取沉渣涂片,无水乙醇固定,免疫荧光染色,镜检。
③脏器标本的检查:取发病动物的肾脏皮质部分,以刀片切出整齐断面,滤纸吸去血液,再以洁净载玻片压印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。经10%甲醛固定的组织可作冰冻切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,荧光抗体染色前以3%表面活性剂如Tween20处理切片,据称,这样可使荧光强度增加4倍。
④培养液检查:同尿处理。
⑤特异性抗体的检查:用适当血清型的钩端螺旋体作抗原,用间接法检查病人血清中的特异性抗体,可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。
本法诊断钩端螺旋体,一般只具有属的特异性,鉴定抗体则可能达到型的特异性。
免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍,此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法,取已知梅毒螺旋体作抗原,检查病人血清中的特异性抗体。
(一)抗原制备
以标准株(如Nicol株)梅毒螺旋体感染家兔睾丸,约1周后待睾丸产生明显炎症,剖腹将睾丸摘除,仔细清除精索、附睾和包膜,然后以灭菌器械将其剪成薄片,置于烧瓶内,加入20ml生理盐水,振荡30min,使螺旋体逸出,2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞,将上清高速离心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理盐水洗涤,再高速离心,洗涤,反复3次以上,以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10,000,000螺旋体的悬液,置4℃保存备用。有效期约半年。
(二)荧光抗体
用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒,必须用抗人IgM荧光抗体。
所有稀释用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。
(三)间接免疫荧光染色方法(FIA试验)
1.定性检查先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4个点,在室温中晾干,丙酮固定10min。各点分别加-1:50稀释待检血清;②-1:200稀释阳性血清;③-1:50稀释阴性血清;④-PBS。放入湿盒,在37℃或室温中放置20min,用PBS振荡洗涤10min,再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体,再同上条件下放置20min,水洗,封裱,镜检。结果如①、②荧光阳性,③、④阴性,待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光,亦有人将待检血清稀释www.med126.com/rencai/1:200作定性检查,这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应,此法又称FTA-200试验。
2.滴度测定如定性检查阳性,则被检血清应进一步稀释成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。
(四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA-ABS)
FTA-200试验敏感性较差,有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA-ABC试验不但敏感性高,而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min,然后高速离心、沉淀,取其上清浸液作为吸附剂,并用以稀释病人血清(1:5),然后如上法(FTA试验)进行染色检查。
FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原,推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液(用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制)中冰冻干燥保存,其中清蛋白起保护剂的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化镁维持螺旋体的形态学,缓冲液稳定pH。
(五)梅毒螺旋体的直接检查法
取梅毒局部硬结渗出液涂片,用直接法或间接法免疫细胞化学染色,更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色,图像更为清晰。