第12章 抗病毒治疗新技术
病毒感染性疾病是严重危害人类健康的常见病。在人类每年流行的传染病中，由病毒引起的约占75%。病毒感染后可引起急性感染，亦可引起持续性感染，并与一些肿瘤、自身免疫性疾病、内分泌疾病及神经性疾病的发生有一定的关系。目前，绝大部分病毒性疾病，特别是慢性病毒感染仍缺乏有效的治疗措施。因此，探索新的抗病毒药物和治疗方法已成为医学研究的热点之一。
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，以及对病毒生物学特性和致病机制认识的不断深入，人们能够在基因水平上寻找抗病毒治疗的新途径，逐渐建立了抗病毒基因治疗技术，并在应用基因工程技术生产新型抗病毒药物等方面取得重要进展。
基因治疗（gene therapy)是指通过基因转移或基因修饰方法，将具有表达功能的基因导入到相关细胞和组织中，使转录或翻译的产物发挥治疗作用的一种治疗方法。进行基因治疗时，应根据宿主细胞病变基因表达水平的异常状况，采取不同的策略，以提高或补足表达水平低下的基因，或降低表达水平过高的基因，或对在正常状况下不表达的基因进行封闭或破坏。
基因置换（gene replacement) 是把正常的外源基因导入生物体靶细胞内，对产生疾病的基因进行置换。理想的基因治疗方式是，将缺陷基因原位校正，并保证患者基因组序列不发生其他改变，能接受体内原有的复杂调控，维持原有的时空表达模式。
基因修正（gene correction) 是将致病基因中发生突变的碱基部分予以更换或原位修复致病基因的功能，并不一定改变致病基因的核苷酸顺序。这种治疗方法颇具吸引力，但是，原位修正基因的策略目前在技术上尚存在许多困难。
基因修饰（gene augmentation) 是将有功能的目的基因导入到发生病变或正常细胞，目的基因的表达产物能补偿致病基因的功能，但致病基因本身并未得到改变。与基因置换和基因修正策略相比，基因修饰容易实现，因此，该策略目前在基因治疗中得到广泛应用。
基因失活（gene inactivation) 是应用各种手段封闭或阻断致病（有害)基因的表达。对于病毒感染性疾病来说，基因失活是一种具有很好应用前景的基因治疗策略。因为从基因水平上将病毒的基因组封闭或破坏后，就不能有效地表达病毒抗原，从而不会产生免疫病理反应。
基因疫苗（gene vaccine) 是用表达载体导入病原体抗原基因，表达的目的蛋白可诱导保护性粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答，或打破对某种病原体感染所引起的免疫耐受，以达到预防和治疗疾病的目的。
基因治疗必须具备以下3个条件：
目的基因的获得 主要方法有：cDNA的克隆，基因的人工合成，基因的聚合酶链反应（PCR)扩增及染色体基因组DNA的降解与克隆等方法。目前基因治疗中应用的目的基因多数是cDNA。
靶细胞的选择 基因治疗的靶细胞有二大类：生殖细胞和体细胞。目前体细胞比生殖细胞的基因治疗发展得更为成熟。靶细胞的选择条件为：根据基因异常表现的器官及其部位；易取出和移植；易在体外进行培养；体外易被转导；具有较长的寿命。
基因转移的方法 将外源性基因导入靶细胞的技术可分为物理、化学和生物学方法三大类。物理化学方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体法、微注射法、颗粒轰击（基因枪)以及电穿孔法等，其优点是简单易行，缺点是携带的遗传物质在细胞内易受DNA酶降解，且不易稳定地存在于细胞基因组中。生物学方法主要指病毒介导的基因转移，包括逆转录病毒（RV)、腺病毒（AdV)、腺病毒相关病毒（AAV)、单纯疱疹病毒（HSV)、痘苗病毒（VV)等，特点是基因转移效率较高，已成为基因治疗应用最广、最有效的基因转移方法。
基因治疗方式主要有两类：一类是直接体内转移（in vivo)，亦称活体直接转移，是将带有遗传物质的病毒、脂质体或裸露DNA直接注射到试验个体内；另一类是间接体内转移（ex vivo)，亦称回体转移，是在体外将目的基因导入到一定的细胞中，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将这些经遗传修饰的细胞输回试验个体内。
exvivo方法较常用，效果较易控制，但步骤多，技术复杂难度大，不易推广；in vivo方法尚未成熟，存在转移效率低、疗效短等问题，但操作简便，容易推广，是基因转移研究的方向。只有invivo基因转移方法成熟了，基因治疗才能真正走向临床。
病毒感染性疾病是病毒与宿主细胞相互作用执业医师的结果，因此，抗病毒治疗应采取既针对病毒，又针对宿主的综合措施。在应用抗病毒制剂抑制或终止病毒在细胞内增殖的同时，还需通过提高宿主的免疫应答，清除体内游离病毒和受病毒感染细胞，从而达到治愈病毒感染的目的。在众多有潜在应用价值的新型抗病毒治疗策略中，抗病毒基因治疗技术尤为令人瞩目，它是基因治疗理论和方法在控制病毒性疾病领域的一个重要应用，同时，抗病毒感染基因治疗的研究和应用又丰富和发展了基因治疗的理论和技术。
在抗病毒感染基因治疗领域，基因修饰和基因失活是目前应用的主要策略。针对提高人体对病毒的免疫力，采用基因修饰技术，将抗病毒的基因导入宿主得到表达；针对降低或消除病毒的致病力，从分子水平上抑制或封闭病毒基因的复制和表达。因此，抗病毒基因治疗策略可以概括为3个方面。
增强宿主免疫力 利用基因转移技术，将目的基因导入体内使其表达，表达的病毒抗原刺激宿主产生抗病毒免疫反应。宿主免疫力具有抵抗病毒感染并从病毒感染中恢复的重要功能。设法将受病毒感染细胞在病毒基因复制和表达之前将其破坏，使病毒不能包装成完整的病毒颗粒，这是设计细胞自杀基因治疗的思路。同时要求将所有受病毒感染的细胞杀死，但对正常细胞没有影响。设计细胞自杀机制主要有三个途径：病毒主导性酶药物预施疗法（VDEPT)、白喉毒素基因表达及细胞凋亡。
促进抗病毒蛋白的产生 将抗病毒蛋白基因导入病人末梢血淋巴细胞或造血干细胞后，再将转基因细胞回输病人体内，通过细胞表达和分泌的抗病毒蛋白进行抗病毒治疗。例如，将可溶性CD4蛋白和IgG蛋白的融合基因或干扰素、白细胞介素等细胞因子基因导入细胞中表达。
细胞内免疫 在感染或非感染细胞内导入某种基因，通过表达的目的蛋白抑制病毒复制和表达，达到抗病毒治疗和预防的目的，即对其中已感染的病毒具有抑制或阻断作用，或对病毒感染的攻击具有抵抗力。针对这类转导的细胞来说，好像是对病毒的感染具有一定的免疫力。但这种形式的抗病毒免疫是由于细胞内目的基因的表达而产生的，故称之为细胞内免疫（intracellularimmunization)，主要有RNA诱饵（RNA decoy)、反义RNA、核酶（ribozyme)、病毒显性突变蛋白和细胞内抗体（intracellularantibodies)等方法，已成为抗病毒感染基因治疗的主要策略。
以碱基配对方式结合、抑制、封闭或破坏基因结构及表达活性的核酸分子，称为反义核酸分子（或称“基因封条”)，包括反义DNA和反义RNA。研究反义DNA或反义RNA的来源、性质及其作用机制的技术称为反义技术（antisense technology)。随着反义技术的不断发展，从反义DNA、反义RNA，已发展到具有酶催化作用的核酶（ribozyme)和多靶位核酶（multi-targetribozyme)RNA分子，使反义分子的类型不断增多。
继发现核酶、反义RNA之后，近年有关小干扰RNA（21-25bp)及其所致的RNA干扰（RNA interference,RNAi)现象又成为研究热点。由于小干扰RNA与对应的mRNA特异结合后，可降解mRNA，因此，可有效地抑制靶基因的表达。RNAi是宿主对外源核酸（如病毒基因)侵入的一种保护性反应，将为病毒感染性疾病的防治提供新手段。
反义DNA、反义RNA、单靶位核酶和多靶位核酶识别底物DNA/RNA分子都是基于碱基配对原则，在基因水平阻断病毒基因复制和表达，因此，反义技术的特异性很高，对宿主细胞几乎无损害作用。反义技术抗病毒感染的机制主要包括以下几个方面：
阻断或抑制病毒DNA的复制与转录 在病毒DNA的复制和转录过程中，双链DNA可解离成为单链状态。反义DNA片段可与DNA双链中的一股以碱基配对方式，形成DNA三聚体（triplet)结构，从而抑制或阻断DNA的复制和转录，达到抗病毒治疗的目的。
阻断RNA的转运 病毒的基因组进入细胞核中，与细胞基因组整合或呈游离状态。病毒基因的转录产物需透过核膜转运至胞质中，经加工后进行翻译。如果病毒的RNA不能正常有效地转运到胞质中，就不能进行复杂的转录后加工。未经转录后加工的mRNA是不能正常进行翻译的。反义RNA亦在细胞核内进行转录，它可与病毒的RNA互补结合，发生RNA的转运扣留。
阻断RNA的转录后加工 病毒转录产物RNA在形成翻译复合体之前，需要进行一系列的加工修饰过程，例如，乙型肝炎病毒（HBV)的mRNA需要在多个位点上进行剪切，以形成结构和大小合适的翻译模板RNA，3'端加poly（A)。反义RNA与病毒的RNA结合，可以阻断这种转录后的加工过程，故称之为转录后的加工抑制。
翻译抑制 病毒mRNA与核糖体RNA形成翻译复合体后才能进行翻译，其结合方式主要有2种：
1．帽状结构依赖性的扫描机制（cap-dependentscanning mechanism，CDSM) 又称为滑动机制，核糖体RNA与mRNA的帽状结构结合与扣留，则顺着模板mRNA从5'端向3'端方向扫描或滑动，当遇到第一个翻译的起始密码子，就可启动翻译过程。直到遇到终止密码子时，翻译才会终止。
2．内部核糖体进入位点（internalribosome entry site，IRES)方式 即帽状结构非依赖性的翻译过程。核糖体RNA直接寻找并结合IRES序列，形成翻译复合体，从一个合适的起始密码子开始翻译。
以上二种翻译机制都需要核糖体RNA与起始密码子上游的RNA模板序列相结合。如果反义分子与此部位上的模板核苷酸首先结合，就可阻断翻译复合体的形成，进而抑制或阻断病毒蛋白的翻译。
破坏病毒RNA 反义技术破坏病毒的RNA有2种主要机制：
1．反义分子与靶mRNA链结合后，可激活内源性的核糖核酸酶如RNaseH等。RNase H可识别、分解DNA-RNA或RNA-RNA双链分子中的RNA链，以破坏病毒的逆转录、加工、翻译及转运过程。
2．核酶RNA分子可利用其活性中心两侧的侧翼序列与作为底物的靶RNA结合，并能识别特异的核苷酸序列，将其裂解。如果设计的是多靶位核酶RNA分子，就可在多个位点上将底物RNA分子进行切割，成为多个碎片。
反义核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON)包括反义DNA和反义RNA，前者是指人工合成的、与靶基因某一区段互补的、正常或经化学修饰的DNA片段，后者是指一类能与靶mRNA互补结合的RNA分子，可参与基因表达的负调控，抑制特异基因的表达。反义RNA可在体内表达或体外合成。反义寡核苷酸作为基因表达的反向抑制剂，应具备足够的稳定性；对目的基因的选择性；对细胞的通透性及靶向性，故应在化学修饰、序列选择、靶向转运等方面加以完善。
近年来，国内外已有大量应用ASON在细胞培养系统中成功地抑制人类免疫缺陷病毒（HIV)、乙型肝炎病毒、疱疹病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、Rous肉瘤病毒等感染的研究报道。
在AIDS的基因治疗中，通过表达有关的互补核酸，以抑制HIV基因的复制、转录和翻译。例如，应用内源性合成的tat、rev、vpu、gag或5'端的引物结合位点等基因的反义RNA，在体外培养的细胞系和CD4＋淋巴细胞中均可抑制HIV-1感染。Tat蛋白是一种反式激活的转录因子，可与HIV-1长末端重复序列TAR位点（tat效应元件)结合，使HIV-1基因表达升高1000倍以上，因此，利用针对TAR的反义RNA可作为一种有效的HIV转录抑制剂。例如，针对HIV-1TAR序列，构建表达反义TAR的重组逆转录病毒载体，将重组体转染Sup T1细胞后，再用HIV-1病毒株攻击，Sup T1细胞内HIV-1病毒颗粒数量明显减少。又如，将反义tat基因导入抗原特异性CD4＋淋巴细胞，同样可以抑制HIV的复制。
有学者构建了一种新的反义类型，即反义tRNA，直接针对HIV-1tat基因第一个编码外显子核苷酸序列（5 924～5 943 nt)，该序列在大多数HIV-1分离株中高度保守。不改变tRNA的四环结构而将抗tat反义序列插入到一个tRNA骨架中，再用逆转录病毒载体将此反义tRNA导入Jurkat细胞株，结果能有效作用于靶位，表现出明显的抗HIV从头感染（denovoinfection)。这是首次将反义tRNA用于HIV-1感染的基因治疗。该策略具有转录体为聚合酶Ⅲ启动子所驱动、反义RNA稳定性高等显著特点。
核酶（ribozyme)是一类具有双重特性的RNA分子，一是能识别特异的靶RNA序列并与之结合，具有反义核酸的特性；二是具有酶活性，能通过特异性位点切割降解靶RNA序列。核酶比反义RNA的阻断活性至少高100倍，它作为抗病毒基因治疗的新型分子，已受到广泛的重视，成为抗病毒基因治疗研究中重要的探索方向。
从分子结构上，核酶主要分为锤头状核酶和发夹状核酶，两者均能催化异体靶RNA的剪切反应。锤头状核酶结构简单，长约30bp，含有一个保守的活性中心和与底物RNA互补的侧翼序列，易于人工设计，所以目前合成的大多是锤头状核酶。
在基因治疗中，主要是在体外设计核酶的编码基因，以逆转录病毒等载体导入到靶细胞中进行表达，再通过核酶切割靶RNA分子，从而阻断病毒特定基因的表达（图11-10)。这一策略经较为周密的细胞及动物水平的系统研究，已用于抗HIV基因治疗的临床试验，并对肝炎病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、鼠白血病病毒等进行了研究。
根据HIV调节基因和结构基因的特点，经人工设计与核酶随机文库筛选，已获得多种发夹状或锤头状的抗HIV-1核酶，其中一些核酶已进入Ⅰ期临床试验阶段。例如，将靶向HIV-1前导序列U5区（连接mRNA帽状结构的起始区)和pol基因的两种发夹状核酶的基因克隆到Moloney小鼠白血病病毒（MoMLV)中，转染AIDS患者CD4＋T淋巴细胞，然后自体回输给病人。在对3例病人为期9个月的研究中，观察了治疗方案的安全性、转染核酶的淋巴细胞在体内的存活期和动力学指标、核酶在体内的表达水平，以及核酶对体内病毒载量、病毒mRNA表达、CD4＋T淋巴细胞水平的影响，结果表明，给病人回输转染了核酶的自体淋巴细胞是安全的；在回输初期，内源性CD8＋细胞、NK细胞和自体回输的T细胞进行了复杂的重新分布。又如，采用靶向HIV复制过程中关键性调节蛋白Tat的锤头状核酶，通过MoMLV将核酶导入自体CD34+造血干细胞，再回输给病人，结果是安全、有效的。
HIV-1基因组的高度变异性是核酶所面临的最大挑战。变异如果发生在核酶的切割位点上，则形成抗核酶的突变株。因此，对于HIV-1这样一个长达近万个碱基且突变率极高的逆转录病毒，在核酶的设计中必须注意以下几点：
1．选择高度保守的RNA切割位点 目前已分别设计出针对HIV-1 RNA中LTR、gag、tat、pol、env、vif、nef等不同高保守序列的核酶，实验结果令人鼓舞。例如，选择HIV-1基因组中高度保守的tat或tat＋rev基因作为靶RNA，设计锤头状核酶，用逆转录病毒载体将核酶基因转入人T淋巴细胞中，结果发现表达核酶的T细胞能成功地抵抗HIV-1感染。
2．多切割位点同时作用 鉴于多个靶位点同时突变的频率比单个点突变的频率要小得多，且只要有一个切割有效就能破坏HIV-1RNA，因此联合应用作用于不同靶点的连接型或独立型核酶，可大大提高切割效率，对于消除HIV-1高度变异带来的不利影响是非常有效的。
3．核酶基因可与其它具有治疗作用的基因协同发生抗HIV-1作用。
可以相信，随着运用逆转录载体技术的提高，对核酶进行化学修饰，及阳离子脂质体导入技术的发展，核酶抗病毒基因治疗途径将发挥更大的作用。
除了上述直接针对病毒的基因治疗研究外，通过导入病毒抗原基因诱生保护性抗体，或导入免疫调节因子基因及其诱导基因等，提高宿主的免疫功能，特别是CTL的杀伤活性，清除受病毒感染细胞等，是发展抗病毒基因治疗的另一有效手段。主要方法有：体内直接注射DNA、抗原基因导入、自杀基因导入及基因替代的CTL过继免疫等。目的基因在细胞内高效表达是实现抗病毒治疗的关键，应从载体和启动子的优化、转送基因方法的改进等方面进行深入研究。
直接注射DNA又称核酸免疫（nucleicacidimmunization)，是近年来从基因治疗研究中衍生而发展的一个新领域（见第13章)。病毒核酸免疫是将病毒基因直接输入病人组织，以模拟自然感染而激发抗病毒免疫应答。核酸疫苗可为裸露的闭合环状质粒DNA或非复制的逆转录病毒载体形式。目前正在研制流感病毒、单纯疱疹病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、狂犬病病毒等核酸疫苗。
HBV的核酸疫苗采用HBsAg和HBcAg的基因，分别构建表达载体，或构建两种蛋白的融合基因，它们均能诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。HCV的DNA疫苗研究主要集中在衣壳蛋白以及非结构蛋白3（NS3)等编码基因区，但也有少数研究采用包膜区E1和E2区进行基因免疫。
HIV的核酸免疫主要集中在编码包膜糖蛋白的基因区。给多种动物注射HIV-1env、tat、rev基因，结果证实动物组织内能表达HIV蛋白，激发细胞免疫和体液免疫应答。将携带有HIV env和rev基因的逆转录病毒载体直接肌肉注射小鼠、猕猴和狒狒，三种动物产生特异针对gp120和Rev蛋白的MHCⅠ类分子限制的CD8＋T细胞反应，CTL反应可长时间存在。由于rev基因的高度保守性，使针对Rev蛋白决定簇的特异性免疫应答能交叉作用于不同的HIV-1临床分离株，因而具有特别重要意义。美国FDA已经批准这种DNA免疫模式用于HIV感染者临床试验。核酸免疫的最大优点是对变异迅速的病原微生物提供交叉防御作用，因此，有望研制出对HIV变异株有效的核酸疫苗，用于HIV感染的防治。
病毒的多种抗原成分可刺激宿主产生一种或多种不同类型的抗体，具有免疫保护作用，这与免疫清除病毒的过程密切相关。因此，将诱生保护性抗体的抗原编码基因导入人体细胞并进行高效表达，也是抗病毒基因治疗的一条重要途径。
研究表明，HIV包膜糖蛋白是诱发宿主产生保护性抗体的主要抗原成分，可作为预防HIV感染的疫苗。应用逆转录病毒载体将HIV-1 gp120基因导入小鼠纤维母细胞系，然后用转染细胞免疫同源小鼠，结果获得MHC限制性的、针对gp120的特异性CTL细胞。将这些CTL输给带有表达HIV-1衣壳抗原的患肿瘤小鼠，可观察到这些肿瘤细胞被CTL特异性杀伤，同时受免疫小鼠体内能产生抗gp120特异性中和抗体，抑制受感染的T淋巴细胞形成病毒合胞体，阻止HIV扩散。进一步用鼠和灵长类动物的自体细胞经转染后回输到体内，也获得同样的治疗效果。以逆转录病毒载体介导的HIV包膜蛋白基因的转移及表达保护性抗体的基因治疗已进入临床试验。
将针对病毒某些组分的特异性抗体基因转染靶细胞后，在细胞内表达的抗体可灭活内质网、胞浆和核内的靶蛋白的活性，从而抑制病毒的增殖。这类抗体称为细胞内抗体（intracellular antibodies)，其构建方法包括杂交瘤技术和抗体库技术。
HIV通过包膜糖蛋白gp120与CD4＋细胞表面的CD4分子、辅助受体相互作用而侵入细胞，造成CD4＋细胞的数量减少，甚至完全丧失。因此，保护CD4＋细胞不受感染的策略之一是，导入HIV-1抗体的基因，表达特异性抗体，中和HIV的感染性。例如，将抗gp120抗体基因克隆到LTR启动子部位，可因HIV感染而诱导表达。抗gp120单链抗体可在内质网上与CD4分子竞争结合HIV-1gp120，并阻止病毒向细胞膜转运，从而抑制HIV的复制。该单链抗体由重链的引导序列、可变区与轻链的可变区通过连接子融合而成。由于单链抗体在没有相应的另一条链的情况下将滞留于内质网，故可将与该单链抗体结合的gp120引到内质网，从而减少其表达。
将HIV-1的cDNA与Gag单链抗体基因插入到逆转录病毒载体，转染T淋巴细胞，发现Gag蛋白表达水平并未改变，但胞内则无完整病毒颗粒存在。此外，针对Tat蛋白、Rev蛋白、逆转录酶、整合酶、内膜蛋白的细胞内抗体均可有效地干扰HIV-1的增殖。
以上结果提示，以HIV抗体的编码基因作为目的基因实施基因治疗是一条很有希望的途径，尤其是在HIV生命周期的不同点阻断其复制的细胞内抗体联合疗法对AIDS的治疗更为有效。不过，HIV基因可编码多种与致病性有关的结构蛋白和调节蛋白，它们作为抗原可激发宿主产生不同的抗体。为优化细胞内抗体表达的抗HIV基因治疗策略，获得更为理想的治疗效果，应选择病毒生存所必需的表位（epitope)，以减少HIV逃逸突变的发生；同时，须对各种抗体抑制或阻断HIV感染的效果进行比较，以找到细胞内抗体的最佳靶点。
免疫因子特别是淋巴因子基因的导入，不仅是抗肿瘤的重要内容，同时也是抗病毒感染基因治疗的重要内容。利用淋巴因子转基因表达是基因治疗在病毒性疾病中的一个重要应用和研究方向。
免疫因子的导入对HIV的感染有直接抑制作用。例如，将人α2干扰素（IFN-α2)基因重组在HIV LTR的启动子下游，转染Vero细胞系，分泌的IFN-α2水平在50～150u /ml，可明显抑制HIV的复制和转录。而用相同剂量的外源重组IFN-α2则不能产生类似效果，提示体内产生的IFN-α2与体外重组的IFN-α2的抗病毒机制不同。如果在上述体系中加入HIV启动子的反式激活剂Tat蛋白或者感染HIV，则可使IFN-α2的表达量分别提高到400u /ml和1000 u/ml。这一系统的另一个特点是，在反式激活因子不存在时，目的基因表达处于低水平，以减少因目的基因的持续高水平表达可能给宿主带来的不良反应。同时，在受到病毒攻击时，病毒提供的反式激活因子则促进目的基因的高水平表达，类似于人体生理的调控状态。
其它种类的淋巴因子，特别是白细胞介素类的基因也是提高宿主免疫力、抵抗病毒感染的重要治疗手段。
1988年Friedman等发现，单纯疱疹病毒（HSV)的反式激活蛋白VP16的缺失或截短突变体（truncatedform)具有明显的抗HSV效应。截短突变体缺少野生型VP16羧基末端的78aa，仍能与野生型的HSV DNA结合，但失去了反式激活效应。能稳定表达该突变体的细胞对HSV的复制具有明显的抑制作用，即产生了免疫力，提示它可与病毒基因组中的顺式激活序列结合，从而干扰相应的野生型蛋白的激活作用。因此，Baltimore于1988年首先提出“细胞内免疫（intracellularimmunization)”这一概念，即将人工构建的一个重组基因导入易感细胞内，表达病毒基因的反义核酸或病毒蛋白的突变体，以便有效地干扰野生型病毒的增殖。
抗HSV基因治疗的策略同样适用于抗HIV的基因治疗。HIV同时具有反式和顺式调节机制，HIV-1生命周期中必需的调节蛋白（Rev、Tat)和结构蛋白（Gag、Env)都有可能作为设计细胞内免疫的目的基因表达产物。目前，抗HIV基因治疗的细胞内免疫法主要包括：HIV蛋白的修饰和RNA抑制剂的应用，前者主要有调节蛋白或结构蛋白修饰，后者主要包括RNA诱捕、反义RNA及核酶等技术。
（一)RNA诱捕
RNA诱捕就是通过某些与病毒调节蛋白具有同源性的RNA超表达，以螯合调节蛋白而抑制其调节功能，从而对病毒的复制和表达产生强有力的抑制作用。诱饵或引诱剂（decoys)方案的设计和应用要求诱饵RNA分子处于量的优势，即必须处于“过表达”状态。
HIV复制与表达的调控过程涉及极为复杂的蛋白-核酸之间的相互作用，其中tat、rev是HIV复制的两个主要调节基因，其表达产物Tat和Rev分别与病毒RNA的转录激活区TAR（tatresponsive element)和Rev效应元件（rev responsive element，RRE)结合，从而调控基因的转录（参见第11章)。因此，Tat-TAR和Rev-RRE在HIV生命周期中显得十分重要，已成为HIV基因治疗研究中的热点之一。
应用RRE和TAR诱饵抗HIV基因治疗的基本思路是：在HIV感染的靶细胞内高效表达一种与TAR或RRE相类似的短RNA，这些诱饵竞争性结合调节蛋白Tat与Rev，阻止调节蛋白与病毒基因组上的相应序列（TAR或RRE)结合，从而抑制HIV的复制、转录和翻译。例如，将HIV-1的TAR或RRE的基因插入到携带polⅢ（tRNAmet)启动子的逆转录病毒载体中，然后转染人T细胞系CEM，获得TAR和RRE超表达，结果在带有这些基因的CEM T细胞中，HIV-1的表达受到抑制。
为了提高Tat序列的诱捕效应，可构建依赖于HIV的诱导性载体，该载体表达的多聚TAR（polyTAR)可与病毒TAR RNA竞争结合Tat蛋白，从而抑制病毒的复制。多聚TAR的表达受HIV LTR调控，活性依赖于HIV Tat蛋白的存在。随着TAR串联子数量的增加，病毒Tat介导的基因表达抑制率随之增加，当TAR串联数达50时，抑制率高达90%以上。
与反义RNA和核酶不同的是，RNA诱饵不受HIV变异的影响，因为TAR和RRE在不同HIV毒株中十分保守。不过，使用这些特定的诱饵RNA作为抗病毒的手段也可阻止与TAR或RRE相关的细胞因子，因此，TAR或RRE在细胞内表达有可能产生细胞毒效应而影响细胞功能。为了降低可能出现的细胞毒性作用，可设计仅含13bp的最小化RRE诱饵，保留其与Rev结合的结构域，抑制HIV的复制，但不能与细胞因子结合。
（二)调节蛋白修饰
HIV某些调节蛋白经突变或修饰后，失去调节功能，但可与天然病毒蛋白竞争结合其目标位点，从而干扰病毒的正常复制，发挥抗病毒效应。HIV的调节蛋白主要是Tat、Rev，其中Tat为反式激活蛋白，能结合到病毒RNA的tat序列上，促进细胞的RNA聚合酶Ⅱ对HIV前病毒的转录；Rev蛋白则在启动HIV病毒结构蛋白和蛋白酶的合成过程中起关键作用。因此，可将突变修饰后的调节蛋白基因导入HIV感染的靶细胞中，表达相应的显性突变蛋白，干扰HIV感染和复制过程，使细胞免受HIV感染。
Tat蛋白突变株 通过缺失tat基因导致其编码产物Tat蛋白无RNA结合或核定位特性，但仍保留活性结构域，结果发现突变的Tat蛋白可抑制HIV的基因表达。构建表达双功能RNA（多聚tat和反义tat)的抗tat基因，已成功地用于螯合Tat蛋白的功能及阻断tatmRNA的翻译。据报道，tat突变体在原代细胞中能控制HIV-1的复制，可在体外感染HIV的正常人外周血单核细胞（PBMC)或者经激活的HIV-1阳性病人的PBMC中观察到这一现象。
tat突变体的抗病毒作用限于低病毒载量，提示可望用于无症状期的HIV感染者的治疗，以控制细胞内病毒的复制而阻断病毒的传播。
Rev蛋白突变株 在调节蛋白中，对突变的Rev蛋白M10研究较多。运用定点突变技术，构建Rev突变体Rev M10（Leu78Glu79→Asp78Leu79)，改变该蛋白C末端富含亮氨酸结构域的稳定性，使Rev蛋白丧失其调节功能，但不影响其与Rev 效应元件RRE的结合特性和形成多聚体的功能。野生型的Rev可形成多聚体，与RRE结合后，通过其调节区域促进未经剪接和经单一剪接的病毒mRNA从核内转移到胞浆中，以便表达病毒包装所需的结构蛋白。而突变的RevM10则可与野生型Rev竞争性与RRE结合，故HIV的复制和表达受到抑制。
利用Moloney鼠白血病病毒为载体，将RevM10基因导入到人T细胞系CEM，可稳定表达Rev M10，并能抵抗HIV-1感染；将Rev M10基因导入人原代T细胞，亦可促进该细胞获得抗HIV感染的能力。
新近报道，用构建的反式显性Rev突变体（transdominantRev，Rev-Td)插入逆转录病毒载体，分别转染Sup T1细胞株和正常CD4＋T细胞，然后用不同的HIV-1病毒（包括HIV-1IHB和MN株及病人初代分离株)攻击，结果这些细胞表达Rev突变体（包括点突变和读框移位)后，HIV-1 gag mRNA的转录和病毒的复制均显著降低，细胞不被病毒破坏。进一步与反义TAR及反义Tat/ Rev转染的Sup T1细胞株医学三基和正常人CD4＋T细胞的实验结果比较，发现Rev-Td能保护70%细胞免受HIV-1的感染，比反义RNA的保护作用（30%～50%)强。应用RevM10突变体等对HIV感染者进行临床治疗的计划已在进行，利用逆转录病毒载体转移抗病毒基因可用于AIDS病人的免疫重建。
（三)结构蛋白修饰
通过结构蛋白的修饰亦可显著干扰HIV前病毒的复制。Gag蛋白在成熟病毒颗粒中以高度多聚化形式存在，该结构的缺失导致HIV不能复制，因此，将Gag蛋白突变体基因导入宿主细胞后可获得表达并抵抗HIV感染。
Env蛋白则是另一被修饰的靶子。例如，将HIV的gp41跨膜蛋白的第2位缬氨酸用谷氨酸取代，构建成Env突变体，再将该突变体基因导入T细胞系内，结果显示，这些细胞系不仅可抵抗野生型HIV-1引起的细胞病变效应，而且降低了HIV前病毒的复制，其机制可能是通过干扰包膜糖蛋白多聚体与受体复合物的疏水性相互作用。又如，gp120上与CD4分子结合的序列被切除后，Env突变体将不再结合CD4分子，并可干扰野生型HIV的复制。
值得注意的是，突变蛋白的作用是抑制病毒表达或干扰病毒成熟，其发挥效应的阶段是在病毒感染整合以后，对感染早期没有抑制效应。由于表达的是外源性蛋白，有可能激活免疫系统产生CTL而破坏突变蛋白的表达细胞。
设计清除病毒感染细胞而非单纯干扰病毒的复制和表达过程是基因治疗研究的另一条重要思路，因此，导入自杀基因（suicide gene)以清除病毒感染细胞在基因治疗中占有重要地位。其基本策略是，将自杀基因导入细胞中，当没有病毒感染时，自杀基因不表达，对正常细胞无损害作用；一旦受到病毒攻击，病毒复制表达过程中的早期蛋白成分为自杀基因的表达提供反式激活剂，从而阻断病毒复制与表达、病毒颗粒的装配与成熟或在细胞之间扩散。
引起细胞自杀的基因种类较多，如某些病毒或真菌的一些酶类基因、白喉毒素基因、促进药物代谢和转换的基因、诱导细胞凋亡的基因等。自杀基因的导入可以有效地杀伤受病毒感染的细胞，但怎样保证细胞自杀的范围仅限于病毒感染的细胞，而对于正常细胞无不良反应是设计的关键。
HIV能逃逸宿主免疫系统的一个重要原因在于HIV进入CD4＋淋巴细胞内增殖，当病毒颗粒成熟释放后，可以从宿主细胞膜上获得保护性外膜，从而再次逃脱宿主的免疫监视。由于宿主自身的CTL反应不能完全清除受病毒感染的CD4＋淋巴细胞，而且随着病程的发展，CTL反应不断减弱。因此，可利用自杀分子杀伤受病毒感染的淋巴细胞，使细胞内未成熟的病毒颗粒失去宿主细胞膜的保护，从而易于被机体及时清除。最常用的自杀基因有单纯疱疹病毒（HSV)脱氧胸苷激酶（thymidinekinase，TK)基因和细菌毒素如白喉毒素基因。
脱氧胸苷激酶基因 HSV-tk基因与前体药物丙氧鸟苷（ganciclovir，GCV)联合是目前应用最广的自杀基因系统。研究发现，将单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（HSV-tk)与潮霉素（hygromycin)抗性基因重组后，经载体导入HIV-1特异的CD8＋T细胞，在体外扩增后再回输到患者体内。HSV-tk基因所编码的TK酶可使无毒性的GCV磷酸化成核苷类似物GCV-P，后者在细胞酶作用下转变成GCV-PP和GCV-PPP，GCV-PPP是毒性极强的三磷酸核苷类似物，它作为底物掺入到新合成的DNA链中，使DNA断裂且抑制DNA聚合酶活性，从而阻断DNA合成，导致分裂期的受病毒感染细胞死亡，达到治疗HIV-1感染的目的。当输入携带该融合基因的CTL后，一旦出现毒性副作用，即可给予GCV，杀死输入的细胞，以保证安全。
可诱导性逆转录病毒载体的应用，为“自杀基因”准确杀伤HIV感染靶细胞创造了条件。将可受Tat诱导的TK表达系统经逆转录病毒载体导入CD4＋T淋巴细胞，tk基因可在受HIV感染的细胞中获得高水平表达，在TK底物存在的情况下，可导致HIV感染细胞死亡和增殖抑制，阻止病毒在细胞间的传播。运用腺病毒载体构建相似的HSV-tk基因表达载体，用该重组载体转染有Tat表达的T细胞和Hela细胞系，当再给予GCV时可使这些细胞死亡。
HSV-tk/GCV系统不仅能杀灭表达HSV-TK的病毒感染细胞，也能诱导相邻的不表达tk基因的细胞死亡，这一现象称为“旁观者效应”（bystander effect)，从而扩大了自杀基因的杀伤作用，同时增强了转染效率。“旁观者效应”的产生机制可能是，转染自杀基因的细胞产生杀伤性物质，通过细胞间隙连接（gapjunction)传递到临近细胞，引起死亡。亦可能与细胞凋亡有关。
白喉毒素基因 自杀基因还包括编码细胞毒素的基因，当该基因表达时细胞即被杀死，应用白喉毒素能实现该目的。白喉毒素由A、B两个亚基组成，A链是毒素的毒性部位，可导致细胞因蛋白质合成障碍而死亡；B链是毒素的结合部位，与细胞表面受体特异性结合。
通过构建编码白喉毒素A链基因的载体，用HIV的LTR控制基因的表达，同时表达结构中含有TAR序列及一段负调控序列，使A链基因的表达依赖于Tat和Rev双重蛋白的作用。体外实验证明，HIV敏感的TH9细胞系受该载体转染后，对HIV毒株感染的保护力可持续59d，受感染的细胞群体产生病毒的能力大大下降，甚至用PCR方法也检测不到病毒的存在，说明保护力是完全的。这是由于在病毒感染早期产生的Tat和Rev的作用，激活并表达白喉毒素，将受感染细胞杀死，因而不能产生足够的病毒传播至其它细胞。可见，细胞毒素基因治疗是一种很有前途的抗HIV基因治疗方法。
依赖于Tat和Rev双重蛋白的白喉毒素基因载体有二大优点：第一，毒素的表达是Tat和Rev双重依赖性的，在HIV感染的细胞中转染该载体能造成HIV复制的实质性抑制；第二，白喉毒素A基因表达的基础水平显著下降，降低了对正常细胞的毒性作用，提高了治疗的安全性。
抗病毒药物治疗是抗病毒治疗中的一个重要组成部分。由于病毒必须侵入宿主细胞内复制才显示其生命活性和致病性，因此，设计抗病毒药物或制剂的策略可分别从病毒感染细胞的吸附与穿入、脱壳、生物合成、装配与释放等不同环节筛选不同药物。目前，抗病毒药物主要包括化疗药物和干扰素，其中化疗药物可分为核苷类似物和非核苷类似物等。
核苷类化合物是最早用于临床的抗病毒药物，其作用机制主要有：
阻止病毒核酸链的延伸 DNA病毒与RNA病毒的复制均需要依赖宿主细胞提供核苷作为病毒DNA或RNA合成的原料。病毒能够利用自身的核糖核酸还原酶，将细胞内RNA水解，再利用自身胸腺嘧啶核苷激酶将胸腺嘧啶核苷转化为单磷酸胸腺嘧啶核苷，在细胞激酶作用下将单磷酸核苷转化为二磷酸和三磷酸核苷而被病毒利用。核苷类似物抗病毒药物可作为病毒复制的原料，在病毒特异的胸腺核苷激酶或类似酶的催化下，转化为磷酸化的核苷类似物而掺入合成的病毒DNA或RNA链中。由于核苷类似物缺少3＇羟基，或因其它修饰而不能使正在合成的病毒核酸链继续延伸，阻断病毒核酸的复制，故这些核苷类药物被称为“链终止剂”（chainterminitor)。
抑制病毒DNA或RNA聚合酶 许多核苷类似物抗病毒药物与细胞内三磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷竞争结合病毒DNA或RNA聚合酶，干扰病毒聚合酶与病毒复制模板和引物的结合，进而抑制病毒聚合酶的活性。
抑制病毒逆转录酶 某些核苷类似物可直接与病毒逆转录酶结合，抑制其活性。
核苷类似物抗病毒药物主要用于疱疹病毒和逆转录病毒感染的治疗，某些药物也用于治疗HBV和HCV感染。该类药物的代表是齐多夫定（ZDV)，是1987年获美国FDA批准的第一个治疗AIDS的药物。目前用于临床的有：双脱氧肌苷（ddI)、双脱氧胞苷（ddC)、司他夫定（D4T)和拉米夫定（lamivudine，3TC)等。其中，拉米夫定亦用于乙型肝炎和丙型肝炎的治疗。另外，丙氧鸟苷（ganciclovir)可用于巨细胞病毒和疱疹病毒感染，无环鸟苷（acyclovir)和碘尿苷（IDU)用于疱疹病毒感染。利巴韦林（ribavarin,商品名病毒唑)可抑制多种RNA和DNA病毒复制。
非核苷类似物抗病毒药物是一类非竞争性抑制剂，共同特性是不需要经过磷酸化，作用靶点是逆转录过程。例如，通过与HIV-1的逆转录酶的活性中心或附近部位结合而抑制逆转录酶的活性。该类药物能够高度专一性地抑制HIV-1的逆转录酶，对HIV-2及其他逆转录病毒的逆转录酶抑制作用很低或无作用，主要有奈韦拉平（nevirapine)、得拉维拉定（delavivadine)、双吡啶氮（TIBO)、吡啶酮（pyridones)等。非核苷类似物与核苷类似物联用对HIV-1复制的抑制有协同作用。
蛋白酶抑制剂，又称肽类似物抑制剂，主要模拟多蛋白水解部位的构型，在感染细胞内与多蛋白竞争结合蛋白酶，从而抑制蛋白酶的活性。蛋白酶抑制剂主要作用于病毒感染晚期，抑制病毒颗粒的成熟，使细胞只能产生非感染性病毒颗粒，因此可阻断病毒传播。
1996年美国FDA批准了3个蛋白酶抑制剂：利多那韦（ritonavir)、沙喹那韦（saquinavir)和印地那韦（indinavir)。这些药物可减少病毒载量，增加CD4细胞计数，主要用于HIV晚期感染者，单药疗效不佳，常与核苷类似物联用。目前已研制出第二代蛋白酶抑制剂如ABT-378、amprenavir、sc521、sc51和CGP61755、KNI-272等。
种类 干扰素（interferon，IFN)是目前最常用的抗病毒药物之一，其抑制病毒复制具有广谱性、间接性、种属特异性及受体依赖性。IFN主要包括α、β和γ3种。IFN-α和IFN-β为Ⅰ型，IFN-γ为Ⅱ型。三种IFN的细胞来源、诱生物、分子结构、抗原性和生物活性各不相同。IFN-α主要由肿瘤细胞、B淋巴细胞、NK细胞或巨噬细胞产生，有耐酸和不耐酸二种。IFN-β主要由病毒核酸或其它外源性核酸刺激纤维母细胞、上皮细胞或巨噬细胞产生。IFN-γ由抗原特异性T淋巴细胞产生。目前三种IFN的基因已被克隆和表达，临床应用的IFN多为基因工程产物。
抗病毒作用机制 IFN诱生剂作用于细胞，使IFN基因活化，转录表达IFN蛋白。表达的IFN分泌到细胞外，与其它细胞或自身细胞上的IFN受体系统结合后，发生配体受体复合物的内在化和降解，激活未受感染靶细胞的抗病毒蛋白基因，表达各种抗病毒蛋白，使宿主细胞进入抗病毒免疫状态而免受病毒感染。与IFN抗病毒有关的蛋白质主要有依赖RNA蛋白激酶（RNA-dependent protein kinase，PKR)、2＇-5′腺嘌呤核苷合成酶（2′-5′-AS)、磷酸二酯酶、Mx蛋白、MHC抗原、β-微球蛋白和肿瘤坏死因子受体等。其中，前四种介导的抗病毒作用尤为重要。
1．依赖RNA蛋白激酶 又称eIF-2蛋白激酶，IFN和病毒双链RNA协同活化细胞内依赖RNA蛋白激酶。活化的蛋白激酶使细胞eIF-2的α亚单位磷酸化，干扰病毒蛋白质的起始翻译。
2．2′-5′AS IFN诱导2′-5′AS基因表达，病毒双链RNA使2′-5′AS活化。活化的2′-5′AS将细胞内ATP转化为许多寡腺苷酸，后者再激活细胞核酸内切酶，使病毒mRNA降解。
3．磷酸二酯酶 能降解2′-5′A为ATP和AMP，同时也水解细胞内tRNA末端的pCpCpA序列，从而抑制蛋白质的翻译。
4. Mx蛋白 是由IFN-α和IFN-β诱导产生的75kDa蛋白，体外研究证实Mx蛋白能抑制流感病毒和水疱口腔炎病毒在细胞内的转录。
除抑制病毒蛋白质合成外，IFN对病毒感染的几乎所有过程均有抑制作用，包括病毒的吸附、穿入、脱壳、复制、表达、装配及释放等。此外，IFN通过诱导细胞MHC抗原表达，增强宿主免疫反应等方式间接抗病毒感染。
应用 IFN主要用于治疗HBV、HCV、HIV和疱疹病毒感染，其中IFN-α是目前唯一证实有效的慢性乙型病毒性肝炎的免疫治疗药物。治疗初期，IFN主要通过诱导表达的抗病毒蛋白抑制病毒感染。用药8～12周，患者常有转氨酶的暂时升高，但血清病毒复制指标的滴度下降，与IFN调节宿主免疫反应引起的抗病毒作用有关。应用IFN治疗HBV和HCV感染的临床指征是：血清HBeAg、HBV-DNA和HCV-RNA中有一项阳性，或肝组织中HBcAg、HCV-RNA和HCV抗原中有一项阳性，患者处于肝功能代偿期时，均可应用IFN治疗。
随着免疫学的进展，免疫调节剂及过继免疫治疗已被应用于病毒感染性疾病的治疗，目的是试图提高宿主免疫功能，增强抗病毒能力，改善病情，清除或抑制病毒。在临床上使用较多的免疫调节剂有短棒菌苗、左旋咪唑、转移因子、特异性免疫核糖核酸、真菌多糖、胸腺素、细胞因子等。
胸腺素（thymosin)是胸腺上皮细胞合成的多肽激素。目前临床应用的有胸腺素F5（TF5)和胸腺素α1（Tα1)，后者的生物学活性较前者高10～1000倍。胸腺素无种属特异性，其主要免疫作用有：连续诱导T细胞不同亚群的成熟和分化，调整B细胞功能；调节免疫平衡作用；增强成熟T细胞、NK细胞对抗原的刺激反应，产生白细胞介素2、IFN等细胞因子。
作为一种生物反应调节剂，Tα1可明显提高机体的免疫功能，近年已广泛作为免疫增强剂，用于临床治疗各种免疫缺陷病、自身免疫病、肿瘤及病毒感染性疾病。
近年来，国内外用胸腺素治疗慢性病毒性肝炎取得一定效果。鉴于单用IFN治疗慢性HBV、HCV感染收效甚微，用Tα1与IFN联合治疗慢性病毒感染具有能使患者获得更有效的组织学改善、病毒载量下降明显、副作用较少等优点。
许多细胞因子参与机体抗病毒免疫机制，其中最重要的是IL-2、IL-12 、IFN-α和GM-CSF。
白细胞介素（ILs)
1．IL-2 为人体最重要、作用最强的T细胞生长因子，能提高T细胞数量和活性以增强宿主的免疫功能，同时诱导增强NK细胞、LAK细胞和CTL效应，促进细胞增殖分化和多种细胞因子的表达。IL-2的抗病毒效应是由IFN-γ介导的，即通过对NK细胞、单核-巨噬细胞及T细胞的激活与趋化作用，诱导这些细胞释放IFN-γ等细胞因子，起到抗病毒作用。
研究发现，用IL-2每周2次肌注治疗慢性乙型肝炎，12周后，57%患者HBVDNA载量降低50%以上，但对HBeAg消除不满意。慢性丙型肝炎对IL-2的治疗应答反应优于乙型肝炎，初步结果显示，部分病例ALT恢复正常，血清HCV RNA转阴。
2．IL-12 是由巨噬细胞等抗原提呈细胞产生的一种异源二聚体细胞因子，主要生物学活性有：增强NK/LAK细胞的溶细胞活性；促进特异性CTL细胞应答；促进活化的T细胞、NK细胞增殖；诱导静止及活化的T细胞及NK细胞、单核细胞分泌IFN-γ，发挥抗感染、抗肿瘤作用；尤其是具有调节Th1/Th2细胞之间的平衡。IL-12不仅对细胞免疫发挥作用，而且直接影响体液免疫，有显著的免疫保护作用。
IL-12可通过增强病毒感染后的特异性和非特异性免疫应答而发挥抗病毒作用，对于多种类型病毒的复制和表达都具有抑制作用。受IL-12刺激的NK细胞和CTL细胞清除受病毒感染细胞的第一步是识别，这涉及MHC限制性的识别过程，而IL-12可以增强受感染细胞中MHCⅠ、Ⅱ类抗原的表达。体外IL-12的抗病毒活性能被抗IFN-γ的单克隆抗体中和，但不能被抗IL-12单克隆抗体所拮抗，说明IL-12的抗病毒作用很大程度上依赖于IFN-γ的诱生。IL-12对HSV、HIV、肝炎病毒感染有良好的治疗作用，国外用IL-12治疗AIDS、慢性丙型病毒性肝炎已进入临床Ⅰ/Ⅱ期阶段。
肿瘤坏死因子（TNF) 是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞和T细胞产生，前者产生TNF-α，后者产生TNF-β。此外，B细胞、NK细胞等受刺激也能表达TNF-α或TNF-β，许多病毒能诱导宿主细胞产生TNF。研究表明，TNF能激活NK细胞，增强CTL识别受病毒感染细胞的能力及调节MHC分子表达，有选择性地破坏受感染细胞，从转录和翻译水平上有效地抑制病毒在细胞中的复制。值得注意的是，近年研究发现TNF能增加某些逆转录病毒复制。因此，TNF的作用复杂，具多样性。
粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子（GM-CSF) GM-CSF来源于激活的T细胞、单核-巨噬细胞、成纤维细胞与内皮细胞等，能促进造血细胞的增殖成熟，增强依赖抗体的细胞毒活性、细胞表面受体抗原表达，并刺激细胞因子的分泌，尤其是IFN-α等抗病毒细胞因子的释放。
GM-CSF在乙型肝炎的治疗和预防中具有十分重要的作用。应用IFN治疗出现白细胞数减少的慢性乙型肝炎患者，改用GM-CSF和IFN联合疗法，结果使HBVDNA水平显著降低，甚至转阴，转氨酶和组织学活性指数也显著降低。国内外临床研究表明，GM-CSF可抑制HBV DNA水平，增强机体抗HBV能力，与IFN联用可更有效地清除HBV。
（一)以疫苗为基础的免疫治疗
多肽疫苗法 是指接种由明确抗原组成的最小结构，激发有效的特异性免疫应答，并避免可能的危害作用。研究发现，HLA-A2阳性者HBcAg特异性CTL最佳识别位点在HBcAg18～27aa，因此提出用该肽作为合成肽疫苗进行免疫治疗以终止病毒感染的设想。动物实验表明，合成肽结合某些佐剂或脂质体，能有效地诱导出CTL反应。在正常人体内进行治疗性HBV疫苗的Ⅰ期临床试验，获得了该疫苗的有效剂量值范围，同时观察到注射4次后诱导的CTL反应持续超过9个月，并证实Th细胞活性在其中的重要作用。新近研究认为有必要联合非特异诱导剂如IL-12、IFN-γ，以调节Th1/Th2型细胞的平衡，可在CTL水平打破其免疫耐受状态。
核酸疫苗法 即直接注射DNA或RNA，这是一种简单而有效的治疗方法，原理是利用病毒不同的结构基因产物可诱发强烈的细胞免疫和体液免疫应答，同时诱导多个表位的CTL反应，可能对治疗某些因基因突变而产生免疫逃避的病毒感染性疾病起重要作用（参见第13章)。
重组蛋白颗粒法 可溶性蛋白抗原免疫通常诱发CD4＋细胞而非CD8＋T细胞反应。研究证实，通过不同途径注射重组裸S抗原颗粒，可在Balb/c小鼠体内诱导出MHCⅠ类分子限制性S蛋白特异性CD8＋CTL应答。S抗原颗粒需要经过一种新型的内体加工途径才能发挥作用。在外源性蛋白抗原加工过程中，树突状细胞、巨噬细胞及外源性β2微球蛋白起重要作用。
（二)以抗原递呈为基础的免疫治疗
抗原提呈细胞（APC)是宿主免疫应答的首要环节，能否进行有效的抗原递呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。而树突状细胞（DC)是目前发现的功能最强的APC，也是唯一能激活初始型T细胞的APC，在免疫应答的诱导中具有独特地位，成熟后高表达MHCⅠ、Ⅱ类分子，同时提供充分的协同刺激信号，在与T细胞结合后强烈激活T细胞，分泌高水平IL-2，主导Th1型应答。DC用于肿瘤免疫治疗，能显著诱导宿主产生抗原特异性CTL。利用DC作为免疫佐剂，刺激宿主产生大量的特异性CTL，可为抗病毒治疗开辟新的途径。
DC用于病毒的免疫治疗主要是通过体外用病毒抗原攻击致敏DC，再回输体内，诱导出病毒抗原特异性的CTL，杀伤病毒感染的细胞。用抗原致敏DC的方法有：通过病毒抗原多肽或蛋白直接冲击DC；用灭活的病毒疫苗共同孵育或活病毒感染；用阳离子脂质体携带病毒蛋白或合成的双链RNA冲击等。有学者用HBV转基因小鼠的免疫耐受模型进行了DC打破HBsAg耐受性的研究，用含HBsAgDNA疫苗只能在一部分小鼠刺激抗体反应，但无特异性CTL反应出现；而用IL-4、GM-CSF活化骨髓来源的DC在所有小鼠均能刺激脾细胞CTL反应，并且活化的转基因DC不需在体外用HBsAg冲击，就能将S抗原内在化并提呈于CTL前体细胞，提示用细胞因子活化的DC进行抗原递呈能够打破免疫耐受状态，引发抗病毒CTL反应。
（王传恩 中山大学中山医学院)
