实验三 结果观察、脓检（1)、突变、仪器 结果观察 细菌在培养基中的生长情况
在液体培养基中生长情况 大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈现均匀混浊状态；少数链状的细菌则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌等专性需氧菌呈表面生长，常形成菌膜。
在固体培养基中生长情况 将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。一般经过18～24 h培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为菌落。挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养。这是从临床标本中检查鉴定细菌很重要的第一步。各种细菌在固体培养基上形成的菌落，在大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐与否，以及在血琼脂平板上的溶血情况等均有不同表现，这些有助于识别和鉴定细菌。 琼脂平板上，可计数菌落，推算标本中的活菌数。这种菌落计数法常用于检测自来水、饮料、污水和临床标本的活菌含量。 脓汁标本的分离 化脓性标本的检验是一个连续的实验。很多细菌感染都可以引起化脓，脓拭子分离培养、鉴定，到药物敏感试验，是一个完整的实验。今天先做： 1. 取标本。无菌操作，取引起病灶的目的菌，而不是污染菌。观察病灶，脓稀薄还是粘稠，又没有新鲜血液混入，颜色、气味如何，作为第一手资料。 2. 做涂片，革兰染色。染色结果与病灶性状相结合，判断出菌的大致范围，分离培养选择合适的培养基和方法。 3. 脓拭子在血平板上进行划线分离。 突变 Ames试验利用细菌突变的原理，使用一组突变菌株，通过检测突变株回复突变率的高低检测化学物质是否具有致突变性，致突变性与致癌性高度相关。菌株：鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型，不添加外援组氨酸则不可生长。待检化学物质溶液浸泡滤纸片，贴到含有微量组氨酸的培养基上，纸片周围形成组氨酸的浓度梯度。组氨酸浓度限量，只可支持菌的几次分裂，无法形成肉眼可见菌落，只有发生组氨酸回复突变的菌才可在平板上形成菌落。化学物质若能引起突变，则有可能使缺陷型回复，纸片周围会出现比其他位置密集的肉眼可见的单菌落。根据菌落多少进行致突变性筛选。此法检测化学物质多，所用时间少，是世界通用的致癌物检测的第一梯队实验。 灭菌仪器 热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类，在同一温度下，后者的效力比前者大。这是因为：①湿热中细菌菌体蛋白较易凝固；②湿热的穿透力比干热大；③湿热的蒸气有潜热存在。水由气态变为液态时放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。
1. 干热灭菌法 干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。一般细菌繁殖体在干燥状态下， 80～100℃经h可被杀死；芽胞则需160～170℃经2h才死亡。
a. 焚烧 直接点燃或在焚烧炉内焚烧。是一种彻底的灭菌方法，但仅适用于废弃物品或动物尸体等。
b. 烧灼 直接用火焰灭菌，适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。
c. 干烤 利用干烤箱灭菌，一般加热至160～170℃经2 h。适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品，例如玻璃器皿、瓷器、玻质注射器等的灭菌。
2. 高压蒸气灭菌法（湿热) 是一种最有效的灭菌方法。灭菌的温度取决于蒸气的压力。在一个大气压下，蒸气的温度是100℃。如果蒸气被限制在密闭的容器中，随着压力升高，蒸气的温度也相应升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸气压下，温度达到121.3℃，维持15～20min，可杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。高压蒸汽灭菌器（autoclave)就是根据这一原理制成的，常用于一般培养基、生理盐水、手术敷料等耐高温、耐湿物品的灭菌。 5 ※<实验四>
实验四 脓检（2)、菌落、血浆凝固酶、药敏试验 上次的实验我们做了革兰染色和平板接种划线分离。菌落是细菌分类的鉴定指标，不同菌有不同特点，上次已经讲过，这次仍然要用这些指标分析你分离到的单菌落。大小（大菌落、小菌落、中等菌落)、形状（圆形、不规则形)、颜色、气味、透明度（不透明、半透明、透明)、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、凹凸情况、边缘整齐与否，有没有色素产生（脂溶性、水溶性)、以及在血琼脂平板上的溶血情况（α－环、β－环、γ－环)。 在血琼脂平板培养基上生长繁殖后，溶血现象分为3类：
① α－环：菌落周围有1~2mm宽的草绿色溶血环，溶血环中的红细胞并未完全溶解。 ② β－环：：菌落周围形成一个2~4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环。溶血环中的红细胞完全溶解。 ③ γ－环：菌落周围无溶血环。 引起化脓性感染的球菌，都是G＋球菌，主要有5种。 a. 葡萄球菌 形成圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径在2mm左右。致病性葡萄球菌常产金黄色脂溶性色素和形成β－溶血环。 b. 链球菌 形成圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径0.5~0.75mm的细小菌落。甲链，致病力弱，α－溶血环；乙链，致病力强，β－溶血环；丙链，一般无致病性，γ－溶血环。 c. 肺炎球菌 形成细小、灰白色、圆形略扁、半透明，有草绿色α－溶血环。与甲型溶血性链球菌很相似。 根据菌落形态和两次革兰染色结果可以初步确定为何菌。 致病性葡萄球菌的鉴定主要根据产生凝固酶和耐热核酸酶试验。阳性具有致病性。最常用血浆凝固酶试验。 凝固酶是能使人或兔血浆发生凝固的酶类物质。致病株大多数能产生，故凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。
a. 试管法：测定游离凝固酶，被人或兔血浆中的协同因子激活为凝血酶样物质后，使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白，从而血浆凝固。兔血浆1：4稀释，加入葡萄球菌，1～4小时后，是否凝固判断阳性，阴性。准确，时间相对较长。 b. 玻片法：测定结合凝固酶。实质是在该菌株的表面有纤维蛋白原受体，当菌混悬于人或兔血浆时，纤维蛋白原与菌受体交联而使细菌凝聚。玻片两端各滴一滴生理盐水，用接种环取分离到的葡萄球菌在两侧的生理盐水中研磨成混悬液。试验侧加一滴1：4兔血浆，对照侧加一滴生理盐水。晃动玻片观察现象，如果对照组不凝而试验组出现颗粒状凝集则说明结果为阳性；如果两侧都不凝为阴性；两次都凝则结果无意义。 甲链和肺炎球菌菌落外观很像，需要用试验区分，以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和奥普托辛试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。 a. 胆汁溶菌试验 肺炎球菌有自溶酶，胆汁激活作用下细菌崩解。加胆汁或10%去氧胆酸钠至菌液，置室温或37℃，在5~10min出现细菌溶解、培养液变清者为肺炎链球菌。甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。 b. 菊糖发酵试验 分别接种菊糖发酵培养基，培养后，肺炎球菌分解菊糖产酸，培养基由紫色变黄色，甲链培养基不变色。 c. Optochin敏感试验 方法似药敏。将待试菌涂布于血琼脂平板表面；取直径6mm无菌滤纸圆片在1:2000 optochin溶液中浸湿，置于平板涂菌处。37℃ 48h后观察抑菌圈大小，肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%)小于12mm。 根据脓汁两次革兰染色结果和鉴定试验，一般可判定为何种菌致病，诊断后进行治疗。链球菌耐药菌株少，鉴定后直接根据经验选药物即可；葡萄球菌要做标准化的药敏试验，常用纸片法，选择效价高又便宜的药。 药敏试验 标准化的药敏纸片，纸片上药物定量，不同药含量不同，给出抑菌环直径大小与药物敏感性的参考值。标准M-H培养基定量每个平板，控制厚度，。液体过夜培养后菌浓调整到一定范围，棉签蘸取涂满平板，不少于三个方向涂布涂满涂均匀。贴上药敏纸片，每两个药敏纸片间隔20mm，距边缘10mm。药敏纸片周围形成浓度梯度，由药敏纸片向周围浓度逐渐降低。药物效果越好，抑菌环直径越大；效果越差，抑菌环直径越小。 5 ※<实验五>
实验五 药敏结果、肠菌特性、生化反应、血清学反应 上次的平板经过16~18温育培养，大家把自己的药敏结果找到，量量抑菌环直径大小，与标准值比较，找出其敏感药物。综合三次实验结果，写出完整的实验报告，从分离鉴定到生化反应、药敏试验，完整的系统的实验报告。 今天是肠道致病菌的检查。 取标本一般取粪便，有些病号取其他样本，中段尿、血液、脓液、脑脊液等。伤寒初期要取血，尿液和粪便2周以后才可以检出，也可取小皮疹。 取粪便直接分离培养，取血液、骨髓接种肉汤增菌。尿液离心后取渣再分离培养。标本接种于肠道鉴别或选择培养基（SS培养基、伊红－美蓝培养基或中国蓝培养基)上，37℃孵育18-24小时。挑取无色半透明可疑菌落，进行初步鉴定，接种双糖培养基。 双糖培养基 下层含葡萄糖的半固体，上层含乳糖的固体，加上酸性复红做指示剂。先穿刺接种再表面划线，观察动力，葡萄糖、乳糖利用能力，是否产气。（颜色变红则可以利用糖，上下层之间出现气柱则发酵乳糖产气，下层有扩散生长则有动力。) 单糖发酵管 液体培养基中只含有一种糖，溴甲酚紫作指示剂，大试管内倒置小试管。接种后培养，可以利用糖的产酸，培养基颜色由紫色变黄色，若产气小试管顶部推出一端气柱。观察产气比双糖培养基敏感的多。至少做五种糖：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇。 VP试验 大肠埃希菌和产气杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为VP试验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性，
甲基红试验 产气杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者经脱羧后生成中性的乙酰甲基甲醇，故培养液pH>5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，是为甲基红试验阴性。大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液pH ≤4.5，甲基红指示剂呈红色，则为甲基红试验阳性。
枸橼酸盐利用试验 当某些细菌（如产气杆菌)利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解铵盐生成氨，使培养基变为碱性，是为该试验阳性。大肠埃希菌不能利用枸橼酸盐为唯一碳源，故在该培养基上不能生长，是为枸橼酸盐试验阴性。
吲哚试验 有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质)，经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。
尿素酶试验 变形杆菌有尿素酶，能分解培养基中的尿素产生氨，使培养基变碱，以酚红为指示剂检测为红色，是为尿素酶试验阳性。
细菌的生化反应用于鉴别细菌，尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。吲哚（I)、甲基红（M)、VP（V)、枸橼酸盐利用（C)四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。例如大肠埃希菌对这四种试验的结果是“――＋＋”，产气杆菌则为“――＋＋”。 血清学试验 若初步鉴定为沙门氏菌，则可用沙门氏A-F群多价血清进行凝集反应确证。发生凝集，则是沙门氏菌。不发生凝集，60℃加热30min后破坏掉Vi抗原再次做沙门氏A-F群多价血清凝集反应，发生凝集是沙门氏菌；不发生凝集则是沙门氏菌A-F以外的菌；若凝集，则可以用特异性血清进行分型。 5 ※<实验六>
实验六 肥达反应、炭疽、肉毒、白喉形态、菌落 肥达反应是诊断伤寒、副伤寒的反应。反应要进行一段时间才能看结果，所以我们先讲怎么做，做上再接着讲原理。 1. 取试管作标记，每排7支，共4排。 2. 加生理盐水0.5ml/管。 3. 加血清作系列稀释，各排第一管加1:10的待检血清0.5ml，倍比稀释至第6管，第7管作对照。 4. 加抗原，每排加一种已知抗原菌液0.5ml/管，混匀，放50℃水浴1h，观察结果。 5. 室温过夜，观察结果。 抗原菌液四排：TH（伤寒杆菌鞭毛型)、TO（伤寒杆菌菌体型)、AH（甲型副伤寒杆菌鞭毛型)、BH（乙型副伤寒杆菌鞭毛型)。 观察结果，鞭毛抗原形成絮状疏松沉淀，浮搁在管底，轻轻振动就可以浮起，易散开。菌体抗原结合时间长，颗粒状凝集紧贴管底，轻摇试管不易散开。计算出现明显凝集的试管的最高稀释度即为效价，进行结果分析。 肥达试验是用已知伤寒沙门菌菌体（O)抗原和鞭毛（H)抗原，以及引起副伤寒的甲型副伤寒、肖氏沙门菌希氏沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作试管或微孔板凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价的试验。
肥达试验结果的解释必须结合临床表现、病程、病史，以及地区流行病学情况。
1. 正常值 人们因沙门菌隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的有关抗体，且其效价随地区而有差异。一般是伤寒沙门菌O凝集效价≥1：80，H凝集效价≥1：160，引起副伤寒的沙门菌H凝集效价≥1：80时才有诊断价值。
2. 动态观察 有时单次效价增高不能定论，可在病程中逐周复查。若效价逐次递增或恢复期效价比初次≥4倍者始有意义。
3. O与H抗体的诊断意义 患伤寒或副伤寒后，O与H在体内的消长情况不同。IgM类O抗体出现较早，持续约半年，消退后不易受非伤寒沙门菌等病原体的非特异刺激而重现。IgG类H抗体则出现较晚，持续时间长达数年，消失后易受非特异性病原刺激而能短暂地重新出现。因此，O、H凝集效价均超过正常值，则肠热症的可能性大；如两者均低，患病可能性小；若O不高H高，有可能是预防接种或非特异性回忆反应；如O高H不高，则可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌（如肠炎沙门菌)感染。
4. 其他 有少数病例，在整个病程中，肥达试验始终在正常范围内。其原因可能由于早期使用抗生素治疗，或患者免疫功能低下等所致。
炭疽芽孢杆菌 革兰阳性，两端平截、粗大，链状竹节样排列，芽胞在有氧条件下形成，呈椭圆形，位于菌体中央，对鉴别有意义。菌落灰白色，粗糙，大，边缘不整齐，在低倍镜下观察边缘呈卷发状。 肉毒梭菌 革兰阳性，粗短杆菌，次端生芽胞呈椭圆形,粗于菌体,位于次极端,使细胞呈汤匙状或网球拍状。 白喉棒状杆菌 菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状。细菌常排列呈V、L等文字形。革兰染色阳性。用美蓝短时间染色菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒，称为异染颗粒。颗粒的主要成分是核糖核酸和多磷酸盐，在鉴定时有重要意义。 5 ※<实验七>
实验七 分枝菌培养抗酸染色、鸡胚接种其他微生物 齐－尼抗酸染色 制片和革兰染色一样，接种环沾卡介苗在玻片上划直径1cm左右的圆。 1. 制片：取牙垢→涂膜→自然干燥→火焰固定 2. 石炭酸复红加热蒸染5分，去滤纸片，水洗→3％盐酸酒精脱色1～2分，水洗→美蓝复染30秒～1分，水洗→吸干、镜检 注意：a. 加热蒸染，涂片以后，盖上滤纸片在涂膜部位，用夹子夹好，加上染液石炭酸复红，酒精灯上加热蒸染5分钟。加热过程中不要蒸干了，要补加染液，不要太烫时加，玻片会裂。控制好距离酒精灯火焰高度，及时添加染液。 b. 脱色时间根据片子厚薄而定，看着没有浓重红色冒出即可。 结果：结核、麻风杆菌类抗酸菌可以抵抗3％盐酸酒精脱色，不能脱去红色，美蓝复染后仍为红色，称抗酸染色阳性。其他菌和物质脱色时脱成无色再用美蓝复染成蓝色，抗酸染色阴性。 怀疑是肺结核的可以直接做痰涂片。抗酸染色的痰涂片上，粘液成分和其他菌蛋白是蓝色，只有结核杆菌是红色。若看到蓝色背景上的红色细长杆菌，则多是结核杆菌。为了提高阳性检出率，可以先用3%盐酸、6%硫酸或4%NaOH 处理15min，降解粘性成分。 培养要把培养基pH调低，最适pH6.5-6.8，培养基要求营养丰富，一般常用罗氏培养基，含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。用大粗试管玻璃纸包扎紧了进行培养，生长缓慢，18小时分裂一次，2-4周可长出干燥颗粒状菌落，呈菜花状或馒头渣状，表面粗糙，边缘不整齐，不透明。 鸡胚接种 病毒分离早期的常用方法，我国汤飞凡最早用鸡胚接种衣原体。 鸡受精卵经过一定时间培养后会形成鸡胚。羊膜腔、卵黄囊、尿囊、绒毛尿囊膜都可以接种，不同病毒选用部位不同。 本次试验选用新城疫鸡瘟病毒，进行尿囊接种。检卵器检卵，标出气室（透光度强亮度大的部位)，鸡胚（最暗的部位)。鸡胚放蛋托上，碘酒在气室消毒，酒精脱碘，锥子烧灼后在气室中间或边缘打孔，无菌注射器取病毒液0.1～0.2ml，垂直进针，穿过气室后注入。蜡油封上孔。下次用这次结果，注意无菌操作。 病毒培养常用三种方法 1. 细胞培养 目前最常用的方法是细胞培养，选择适当的原代培养细胞(敏感性高)及传代细胞系(便于在实验室保存)作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类。 2. 鸡胚接种 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血凝抑制试验以鉴定病毒。此外，细胞培养也可应用。分离流感病毒在发现新变异株中具有重要价值。 3. 动物试验 接种动物分离病毒的方法目前已很少应用，但对狂犬病病毒及乙型脑炎病毒的分离与鉴定中还需应用动物接种，并结合用特异抗体作中和试验或作免疫荧光染色以鉴定病毒种类。 观察标本 白色念珠菌 真菌，大、紫色、球菌 钩端螺旋体 银染，黄色背景下深棕黑色细线状，一端或两端有钩 结核杆菌痰涂片 红色细长杆菌 5 ※<实验八> 实验八 鸡胚收剖、血凝、鼠脑接种、真菌培养 鸡胚收剖 上次做了鸡胚接种，这次做鸡胚收剖。把鸡胚放蛋托上，先消毒蛋壳气室处，用剪子或镊子敲开个口，剪掉气室，揭去第一层卵膜，剪开绒毛尿囊膜，用吸管收集尿囊液。 血凝试验 某些病毒具有血凝素，可以使人或动物的红细胞凝集，可以通过血凝试验确定有无具有血凝素的病毒存在，其效价高低。 1. 血凝板上第1个孔加0.4ml生理盐水，其余9孔加0.25ml生理盐水。 2. 收剖鸡胚取尿囊液0.1ml加入第1孔，倍比稀释至第9孔，第10孔作对照。 3. 加1％新鲜鸡血球液，每孔0.25ml，混匀后，室温静置1h观察结果。 结果判定 第10孔对照血球自然沉降到孔底，成光滑圆点状，整个系统可用。以对照孔依次向前看，根据凝集现象记录结果。血凝效价以最先出现的＋＋为准。计算效价出现的稀释度。 血凝试验只能检查是否有具有血凝素的病毒存在，要确定是哪一种病毒，还要做血凝抑制试验。 血凝抑制试验 样本液先加入特异性抗体作用一段时间，如果是相应的抗原抗体结合则封闭住血凝素位点，加入血球有血凝抑制现象。对照组设三组：病毒对照，抗体对照，缓冲液对照。三个对照组均正常结果才有意义。 鼠脑接种 实验动物接种途径很多，脑、腹腔、皮肤、皮下均可。本次实验学习鼠脑接种。 抓老鼠，消毒眼耳连线中点，注射器取病毒液（染液代替)向其扎入，有镂空感时即进入颅骨，注射即可。 注入接种完就拉颈处死，进行鼠脑收剖。 枕后部皮肤横剪开，再纵剪，脑袋皮肤剥开，剪开颅骨，看看你的病毒液注射到哪个部位了，注射到的地方会被染蓝。 真菌培养 真菌营养要求不高，菌落形态有两种。 1. 酵母型菌落 是单细胞真菌的菌落形式，菌落光滑湿润，柔软而致密。形态与一般细菌菌落相似，如隐球菌。有部分单细胞真菌在出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离，形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长，伸入培养基中，这种菌落称为酵母样菌落，如假丝酵母菌。 2. 丝状菌落 是多细胞真菌的菌落形式，由许多疏松的菌丝体构成。菌落成棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正背两面呈现不同的颜色。丝状菌落的形态、结构和颜色常作为鉴定真菌的参考。真菌有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向，所以临床体癣、股癣、叠瓦癣等皮损表现为环形或多环形。 真菌培养常用大培养柯氏瓶点种接种。 若要区分酵母型和酵母样菌落，可作小培养。载玻片上用蜡粘上钢圈，加入一半培养基，，点种后盖上无菌盖玻片，培养后镜检观察。 观察。 大分生孢子 体积较大，由多个细胞组成，常呈梭状、棍棒状或梨状，中间有分隔。其大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据。 小分生孢子 较小，1个孢子只有1个细胞，如小米粒状。不是鉴定依据。
| 
