关键词： 消化系统肿瘤/治疗；自杀基因；基因疗法
Subject headings digestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
在恶性肿瘤的各种基因治疗中，自杀基因(suicide gene)/前药(prodrug)系统备受关注. 目前已在多种肿瘤进行大量临床前研究，有的已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验. 该疗法对消化系肿瘤的治疗作用，业已得到证明［1］. 不管哪一种自杀基因/前药系统，均需有下列3个成分：①能编码一种酶的自杀基因：该基因通常来源于病毒或真核细胞，其编码的酶能将无毒的前药转变为活性毒物，引起靶细胞死亡；在缺乏前药的条件下，该种基因的表达对机体无害；该基因编码的酶对基质(前药)应具有高度催化效能(高Kcat)［2］. ②基因转移载体(gene-transfer Vectors)：为了转移自杀基因至靶细胞，一般采用基因工程改造的逆转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相关性病毒(adenovirus-associated viruses)作为载体［3］. 也有人采用阳离子脂质体作为载体，发现其对内皮细胞有高度亲和力［4］. 基因转移的关键是其靶向性(targeting)［5］. 如将甲胎蛋白(AFP)启动子和清蛋白增强子(Alb)TRS连接自杀基因，则后者便仅于表达AFP的肝癌细胞中表达，而不影响正常肝细胞［6］. ③能被自杀基因编码的酶作用的前药(prodrug)：这种前药在自杀基因不存在时，对机体无毒或仅有微小毒性，而在自杀基因编码的酶特异性作用下，前药转化为活性药物，后者的细胞毒性较无活性的前药至少强100倍.
1 自杀基因/前药系统
1.1 单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-tk/GCV)系统 表达单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纤维细胞，对戊环鸟苷(ganciclovir, GCV)的敏感性较野生型细胞强1000倍，在BALB/c小鼠，给予GCV，可使表达HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退缩. 上述发现奠定了HSV-tk/GCV系统的基础. GCV本身无毒性，在HSV-tk作用下，变成GCV单磷酸盐(GCV-MP)，再经内源性细胞激酶作用，迅速转化为其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸盐(GCV-TP)，后者对增殖中的哺乳细胞具有高度毒性. 虽然哺乳动物细胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的转化，但HSV-tk的作用比其强200倍. GCV-TP具有羟基，能插入DNA链中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳定［7］；GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶，进一步阻止DNA合成［8］. 在暴露于GCV后，表达HSV-tk的哺乳动物细胞内迅速聚集GCV磷酸盐，而未表达HSV-tk的野生型细胞则无GCV磷酸盐测得；将HSV-tk转染的细胞与3H标记的GCV一起孵育，发现放射性标记物迅速而稳定地掺入细胞DNA内. 应用IH核磁共振分光镜检测，发现肿瘤组织在HSV-tk/GCV治疗后，含胆碱物质的显性弥散系数减少50%，而迅速弥散性水成分的显性弥散系数增加219%，细胞内粘滞度明显增加，而大分子物质的流体动力学面积可能减少［9］；动力学分析显示细胞内P53蛋白水平先增加，继之cyclin β1蛋白水平升高，细胞周期中止于S/G2［10］. 上述事实说明HSV tk/GCV引起肿瘤细胞凋亡. HSV-tk/GCV系统不仅能杀灭表达HSV tk的细胞，且具有显著的旁观者效应(bystander effect, BSE).
无论是体外抑或体内实验均观察到，GCV剂量越大，培养中的HSV-tk+细胞被杀灭的比例和肿瘤退缩率也越高，荷HSV-tk+瘤的动物生存期也越长. 至于HSV-tk本身的表达水平，一般与对GCV的敏感性不具有相关性，但不完全如此. 此外，细胞对HSV-tk/GCV的敏感性尚取决于担负着GCV二-和三磷酸化的细胞激酶的活性、细胞增殖速率以及将GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性［11］. 有人认为，GCV被HSV-tk+细胞摄取较慢，亲和力较差，不是很理想的HSV-tk基质［12］. Balzarini et al［13］发现，Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代谢物在HSV-tk+细胞内停留时间较GCV代谢物长1倍以上，且E-GCV在血浆中较GCV稳定，因此如用作HSV-tk系统的前药，其作用至少比GCV强10倍；Tong et al［14］发现，如果用无环鸟苷(acyclovir, ACV)代替GCV作为前药，并使用较GCV常用剂量高2.5～5.0倍的剂量，则引致的旁观者效应明显高于应用GCV作为前药时.
1.2 带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系统 与HSV-tk不同，带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase， VZV-tk)对GCV亲和性甚弱，而对前药阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脱氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2＇-deoxyuridine ,BVdU)具有亲和力，能选择性催化二者磷酸化，再在细胞内酶作用下，最后生成三磷酸盐，分别为Ara-ATP和BVdU-TP［15］. 野生型细胞对高达1500μmol/L浓度的Ara-A和75μmol/L～250μmol/L浓度的BVdU均不敏感，而对表达VZV-tk的细胞，低至1μmol/L～100μmol/L浓度的Ara-M和0.06μmol/L～0.6μmol/L的BVdU即呈细胞毒性［16］.
1.3 胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系统 胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大肠杆菌和某些霉菌表达的一种酶，不存在于哺乳动物细胞内，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌药5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)经CD脱氨后，生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)，再经细菌内酶作用，生成氟脲嘧啶三磷酸盐(5-fluoro-5＇-trip hosphate)和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐(5-fluoro-2＇-deoxyuridine-5＇-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase)，阻抑DNA，RNA和蛋白合成，引致细胞死亡. 一般选用大肠杆菌的CD基因作为自杀基因. 应用5FC作为前药，有不少优点，例如，人的细胞酶不能使5FC脱氨，因此在通常剂量下5FC几无毒性；口服吸收良好(＞80%)；能透过血脑屏障等［1］. 表达CD的哺乳动物的细胞在暴露于5FC后. 细胞内迅速产生可测定水平的5FC，胸苷酸合成酶受抑，广泛形成RNA皱缩物(RNA adduts). 由CD/5FC介导的细胞死亡发生较HSV-tk/GCV引起者为慢［17］，可能由于5FC被摄取和转化较慢所致. 但CD/5FC引起的细胞杀死作用不一定弱于HSV-tk/GCV，主要由于前者往往有更强的旁观者作用. 如同HSV-tk/GCV一样，前药5FC的细胞毒性作用也呈现剂量相关性，在某些敏感的细胞系如结肠癌，细胞毒性与CD表达呈正相关［18］，但在对5FU不敏感的肉瘤细胞，此种相关性不明显，看来，细胞毒作用的强弱可能最终取决于特殊细胞系对5FU的内在敏感性. CD/5-FC系统也显示旁观者效应，与HSV/GCV时相似，但机制不同［19］.
1.4 细胞色素P450微粒体酶CYP2B1/环磷酰胺(CYP2B1/CPA)系统 自大鼠肝分离出的细胞色素P450微粒体酶CYP2B1，能催化化疗药环磷酰胺(CPA)和异环磷酰胺(IFF)，生成4羟环磷酰胺(4HC)，再迅速转化为短寿命的烷基化物磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard)，引致细胞DNA损伤. 在体内，转染CYP2B1基因的细胞对CPA的敏感性较野生型细胞高15倍～20倍. 该系统具有中等强度的旁观者效应. 该系统对累及某些特殊部位如脑、脑膜的肿瘤可能具有特殊作用. CPA能自由地透过血脑屏障，但CPA转化为4HC主要发生于肝内，而4HC不易透过血脑屏障. 如将CYP2B1基因转导入脑瘤内，再给予CPA，则局部生成的4HC可对脑瘤发挥细胞毒作用. 在进行自身骨髓移植的肿瘤患者，可利用CYP2B1/CPA清除骨髓内瘤细胞. 4HC对正常造血细胞和肿瘤细胞均有毒性，如将表达CYP2B1的腺病毒载体转染骨髓，由于造血细胞缺乏腺病毒表面受体，因此仅有肿瘤细胞被CYP2B1基因有效地转染，从而被毒性4HC杀灭，而正常造血细胞不受危害［1］.
1.5 细胞色素P450 CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)系统 免细胞色素P450 CYP4B1能选择性作用于前药氨基蒽(2-aminoanthracene, ZAA)或4-ipomeanol (4-IM)，使之转化为活性物质烷化剂不饱和性或乙醛呋喃环氧化物(aldehyde furan epoxide［20］). 此种活化药物在很低浓度即显示高度DNA毒性. 体外实验表明，只要有1%的细胞表达CYB4B1，即有显著的旁观者效应.
1.6 脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)系统 临床上发现，抗白血病的核苷酸类药物如阿糖胞苷(Ara-C)、2-氯脱氧腺苷(2CdA)和fludarabine的效应与白血病细胞表达脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)的水平相关. 这些前药在细胞内活化的关键步骤是被dCK磷酸化. Ara-C虽为造血系统恶性肿瘤的有效药物，但对实体肿瘤作用有限. 人dCK能将Ara-C在细胞内磷酸化，使其细胞毒性增加. 有人用逆转录病毒或腺病毒，将dCK基因转染至神经胶质瘤细胞，使这些瘤细胞对Ara-C敏感性明显提高［21］.
1.7 乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6TX)系统 大肠杆菌的乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(guanosine-xanthine phosphoribosyl transferase, gpt)基因表达产物，既能增强被转染细胞对硫黄嘌呤的敏感性，也能增强对mycophenolic acid、黄嘌呤和次嘌黄嘌呤的抗性，从而可对被转染细胞进行正、负选择. gpt能使6-硫黄嘌呤(6-thioxanthine, 6TX)和6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)磷酸化，增加转染gpt基因细胞对该两种前药的敏感性. 鼠神经胶质瘤细胞被逆转录病毒转染gpt基因后，对6-TX的敏感性提高50倍～100倍.［22］. 给予无胸腺鼠颅内C6肿瘤内移植gpt-逆转录病毒载体产生细胞，随后给予6TX，引起肿瘤缩小80%，生存期较对照组明显延长［23］.
1.8 硝基还原酶/CB1954(NTR/CB1954)系统 大肠杆菌的硝基还原酶(nitroreductase, NTR)对基质5-(aziridin-1-yl)-2, 4-dinitrobenzamide (CB1954)具有高度催化活性，能迅速将其还原为一系列羟胺类烷化剂. 表达NTR的细胞对CB1954的敏感性较野生型细胞高500倍，且具有强大旁观者效应［24，25］. NTR也能激活一些抗菌药如硝基呋喃妥英(nitrofuratoin)和甲硝唑，使之具有细胞毒性，但不显示旁观者效应［25］.
1.9 嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷(PNP/6-MeP-dR)系统 大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)基因编码的酶能激活相对无毒性的6-甲基嘌呤脱氧核苷(6-methyl purine-deoxyriboside, 6-MeP-dR)，生成高毒性的6-甲基嘌呤(6-methylpurine, 6-MeP). 用逆转录病毒载体将PNP基因转达给小鼠黑素瘤和乳癌细胞，再暴露于6-MeP-dR，发现黑素瘤细胞被选择性杀灭. 该系统具有强大旁观者效应，只要有1%的细胞表达PNP，即可引起大多数非转染细胞死亡.
1.10 胸腺嘧啶磷酸化酶/5＇-脱氧-5-氟尿嘧啶(TP/5＇-DFUR)系统 胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)能催化胸腺嘧啶或脱氧尿嘧啶，生成1-磷酸脱氧核糖. 对于前药5＇-脱氧-5氟尿嘧啶(5＇-deoxy-5-fluorouridine, 5＇-DFUR)或1-(tetrahydrofuryl-5-fluorouracil, Tegafur), TP使之转化为5FU. 业已证明该系统可使人MCF-7乳癌细胞对5＇-DFUR的敏感性提高1000倍. 该系统也呈旁观者效应.
1.11 羧基肽酶G2/CMDA系统(CPG2/CMDA) 假单胞菌属(Pseudomonas)RS16产生的羧基肽酶G2(carboxy peptidase G2，CPG2)可使4-(［2-chloroethyl］［2-mesyloxyethyl］amino)benzyol-L-glutamic acid(CMDA)分解为苯甲酸衍生物，后者为强毒性烷化剂. CMDA不易进入细胞，不能被细胞内表达的CPG2活化，但如果应用基因工程方法让CPG2在细胞膜表面表达，则CMDA便易被激活，从而显示细胞毒性［26］.
1.12 羧酸酯酶/CPT-11(CE/CPT-11)系统 兔羧酸酯酶(carboxylesterase, CE)能使化疗药CPT-11(irinotecan, 7-ethyl-10-［4-(1-piperidino)-1-piperidino］ carbonyloxycamptothecin)转化为其活性形式SN38(7-ethyl-10 hydroxycamptothecin)［27］. 人横纹肌肉瘤细胞被免CE基因转染后，对CPT-11的敏感性较之野生型细胞高8倍以上. 从CPT-11转化为SN38的过程具有同工酶特异性，在人，主要由肝内CE-Ⅰ催化.
1.13 复合系统 联合应用不同的自杀基因前药系统可能比单一系统更有效［28，29］. 例如，联合应用CD/5FC和HSV-tk/GCV系统，前者产生的5FU可抑制胸苷酸合成酶，减少胸腺嘧啶生成，相应减少在HSV-tk活性部位胸腺嘧啶和GCV的竞争，从面增强HSV-tk/GCV系统的效应. 给鼠9L神经胶质瘤同时转染CD和HSV-tk两种基因，可使杀灭肿瘤所需的5FC和GCV最低浓度下降50%以上.
2 作用机制
基因转移载体将自杀基因转染给肿瘤细胞，在自杀基因表达的特殊酶作用下，本身无毒或微毒的前药在局部被激活，转化为高度毒性药物，从而将瘤细胞毒杀灭. 表达这种酶的瘤细胞越多，被杀灭的细胞越多. 此为直接细胞毒效应. 但实践中发现，为了取得肿瘤退缩，并不需要每个肿瘤细胞均表达自杀基因，换言之，在自杀基因/前药系统介导的肿瘤治疗中，被杀灭的细胞数远超过表达自杀基因的细胞数. 这是由于在前药存在下，基因改造的瘤细胞能引起未经基因改造细胞的细胞毒性和死亡. 这种现象即前已述及的旁观者效应(bystander effect, BSE). 此种效应有力的增强了自杀基因/前药系统的作用，但因细胞系和酶/前药不同而差异很大，可以不存在，也可以很强大，以致肿瘤内只要有1%～5%的转染细胞即可引起几乎全部瘤细胞死亡. 前述的各系统中，许多均显示这种效应. BSE产生的机制尚不完全清楚，主要有：
2.1 单纯弥散作用 某些激活的前药(如5FU)为可溶性分子，可自由地在细胞-细胞之间弥散，从而引发BSE. 在CD/5FU系统，暴露于5FU后，CD+细胞培养液中很快可测出5FU. 在细胞水平，BSE取决于5FC被基因改造细胞转化为5FU的速率、5FU弥散至邻近未基因改造细胞的速率，以及靶细胞对5FU的内在敏感性. 如果肿瘤细胞本身对5FU敏感，则从邻近基因改造细胞弥散而来的5FU，即使浓度很低，也呈现细胞毒作用.
2.2 代谢协作作用(metabolic cooperation) 在某些自杀基因系统，例如HSV-tk/GCV，活化的前药GCV-TP为荷电分子，不能被动地穿越细胞膜，但在HSV-tk+细胞和野生型细胞共培养中，却在后一种细胞内显示有高浓度GCV-TP［30］. 现认为，这是HSV tk+细胞内GCV-TP经过细胞的裂隙连接(gap junction)转移给野生型细胞的结果. 裂隙连接系由结合蛋白(connexons)组成的特殊细胞膜结构. 结合蛋白由connexins装配而成，为一六聚体圆柱形蛋白，中心有孔道. 不同细胞之间的裂隙连接形成“代谢协作”管道，经过此管道，一些小电荷分子能在细胞间流动. GCV-TP分子甚小(＜1000)，能透过裂隙连接. 业已证实，在HSV-tk/GCV系统中，细胞-细胞接触是细胞杀灭作用所必需；细胞间裂隙连接与BSE强弱密切相关，而裂隙连接的透过性又与connexins 43,37,32和26的表达水平有关. 缺乏BSE的细胞系在转入connexins 43基因后，显示BSE. 胰癌细胞呈现的BSE强于某些胃肠癌细胞，前者的connexins 43和connexins 26 mRNA表达水平，比后者分别高8倍～26倍和2倍～229倍［31］. 为了强化BSE，可通过药理学方法疏通裂隙连接或增强其表达. 由HSV-tk+和野生型肿瘤细胞混合物构建的鼠间质细胞瘤，如果同时接受GCV和维生素A酸(retinoid acid)，其肿瘤消退作用加快，这种作用即使在HSV-tk+细胞与野生型细胞的比例低至1∶40时仍存在. 已知维生素A酸能增加connexins 43的表达，促进小分子色素在细胞之间转移，而其本身对肿瘤大小并无影响，由此推测，维生素A酸之所以能强化HSV-tk/GCV的作用，系由于其能加强裂隙连接的透过性，强化BSE所致［32］. 其他能增强HSV-tk/GCV BSE杀伤作用的物质尚有黄酮类apigenin、胆固醇合成抑制剂lovastatin. 已知细胞酪氨酸激酶能使connexins磷酸化，减弱裂隙连接的透过性，而lovastatin能抑制该酶活性，从而增强裂隙连接的通透性：apigenin可能会增加裂隙连接的表达. 相反，cAMP活化剂forskolin和钙通道阻滞剂硝苯吡啶能减弱BSE.
2.3 免疫介导作用 给动物在两个不同部位分别移植HSV-tk+肿瘤和野生型肿瘤，再给予GCV，发现野生型肿瘤也退缩，这种现象称为“距离性旁观者效应”(“bystander effect at a distance”)，提示体内出现抗肿瘤性免疫反应［33］. 下列事实提示这种免疫反应的存在：①给小鼠植入含有HSV-tk+和野生型细胞的肿瘤，再接受亚致死量照射，发现BSE减弱；②在免疫缺陷性荷瘤BALB/c小鼠，HSV-tk/GCV的BSE弱于免疫功能正常的荷瘤鼠；③接受HSV-tk/GCV治疗的荷瘤动物，对同源肿瘤的再接种呈现特异性抗体反应［34］；④前列腺癌鼠模型接受HSV-tk/GCV治疗期间，如果去除自然杀伤细胞(NK)，则原发肿瘤的抑制作用减少20%，肺转移癌的生长不能被抑制［35］；⑤HSV-tk/GCV介导的肿瘤坏死伴有明显炎细胞浸润，CD4+和CD+8T细胞集聚、瘤内白介素-12(IL-12)水平增高，这与环磷酰胺引起的坏死不同，后者缺乏炎症反应［34］. 自杀基因/前药促发的免疫反应的原理尚不清楚，可能由于肿瘤细胞坏死后，抗原成分更多地暴露，或在对坏死细胞的炎症反应中，抗原提呈细胞得到补充或激活，从而引发延迟型肿瘤免疫反应，如同体内产生活的抗肿瘤疫苗. 有人认为CD基因表达的CD蛋白本身具有超级免疫原性，可刺激淋巴细胞产生交叉免疫反应. 进一步研究表明，免疫反应的出现与细胞因子的表达有关. HSV-tk+细胞暴露于GCV后，体内α肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、IL-6、γ干扰素(IFN-γ)和粒细胞菌落刺激因子(GM-CSF)水平均提高；HSV-tk+细胞表面共刺激性分子(costimulating molecules)ICAM和B7的表达增加. 有人发现，如果免疫缺陷性HSV-tk载体同时表达TNF-α，则HSV-tk/GCV抗肿瘤效应明显提高.
2.4 其他作用 有人认为，死亡的HSV-tk+细胞可释放含GCV-TP凋亡囊泡，野生型肿瘤细胞吞噬这些囊泡后会死亡. 但这些囊泡出现较迟，不能解释早期发生的BSE. 有人认为HSV-tk/GCV可引起血管内皮细胞基因改造，通过对肿瘤血管的破坏而引发BSE［36］. 已知转染HSV-tk基因的大鼠脑瘤，在暴露于GCV后，瘤内血管明显减少.
3 消化系肿瘤的治疗
迄今，已在许多肿瘤试验了自杀基因疗法的治疗作用，这些肿瘤包括黑素瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、腹膜癌、宫颈癌等，但多半为体内、外临床前研究，真正进入临床Ⅰ/Ⅱ期研究的仅见于恶性胸膜间皮瘤(美国)、成胶质细胞瘤和转移性黑素瘤(法国)等少数肿瘤. 在消化系肿瘤中，研究较多的是关于HSV-tk/GCV和CD/5FC对肝癌、结肠癌、胰癌和胃癌的治疗作用.
3.1 肝癌 1993年Caruso et al［37］首先报告向大鼠实验性转移性肝癌组织内，注入含有表达HSV-tk重组逆转录病毒的包装细胞，再给予GCV，引起肿瘤明显退缩，瘤细胞数平均减至对照组的1/60. 应用重组腺病毒作为HSK-tk基因的载体，也得出类似结果. Kwong et al［38］给鼠肝植入乳腺癌细胞，制造实验性肝癌，2wk后，瘤内注入表达HSV-tk的复制缺陷性腺病毒载体，结果显示肿瘤明显退缩，生存期明显长于对照组(P＜0.01). HSV-tk/GCV可能特别适于治疗肝肿瘤，这是因为：①迅速分裂的肿瘤细胞生长于非增生性、相对正常的肝组织中，而用于基因转移的逆转录病毒载体对增殖旺盛的细胞最有亲和力. 体外实验表明，HSV-tk基因转染的肝肿瘤细胞对GCV的敏感性是野生型细胞的500倍～1000倍［39］；②由于70%的肝细胞癌表达甲胎蛋白(AFP)，而正常肝细胞不表达此种蛋白，因此如应用AFP基因作为启动子，可提高基因转录载体的靶向性，增加目的基因转染肝癌细胞的效果［6，39-41］；③，由于肝肿瘤的血液供应主要来自肝动脉，因此如果从肝动脉输注基因转移载体和前药，可能进一步增加基因转移的靶向性，减少副作用［39］. Gerolami et al［42］在二乙基硝胺肝癌鼠模型，比较了经门脉、肝动脉和瘤内直接注射等3种途径输注重组腺病毒载体的效果，发现以肝动脉输注产生的肿瘤抑制效应最显著. HSV-tk/GCV对肝肿瘤的抑制作用尚见于肝外输注自杀基因时，此很可能系“距离性旁观者效应”发挥了作用. 向鼠腹腔内注入HSV-tk+和HSV-tk-结肠癌细胞，10d后，再向肝内注入HSV-tk-结肠癌细胞，所有动物均接受GCV. 结果显示，不仅腹腔内HSV-tk+肿瘤和HSV-tk-肿瘤相比，明显退缩，而且肝内HSV-tk-肿瘤在腹腔HSV-tk+肿瘤鼠也小于腹腔HSV-tk-肿瘤鼠. 腹腔HSV-tk+肿瘤鼠的肝内肿瘤内有大量单核细胞浸润，伴纤维化，仅偶见存活的肿瘤细胞.
3.2 结直肠癌 CD/5FC系统看来更适合于治疗结直肠癌. 体外实验表明培养的结肠癌细胞中只要1/3表达胞嘧啶脱氨酶(CD)，即足以使前药5FC转化为足够浓度的5FC，而使全部癌细胞的生长受到抑制；皮下移植的结肠癌组织中只要2%的癌细胞表达CD，在给予5FC后，肿瘤生长即完全停止. 如果将载有CD基因的腺病毒载体，直接注射入裸鼠皮下移植性结肠肿瘤内，再给予5FC，引起肿瘤缩小3/4～4/5. Rowley et al［17］报告表达CD的结直肠癌细胞对5FC的敏感性，比不表达CD的腺癌细胞高200倍以上，在7d内，90%以上癌细胞被杀死. 有人比较了经基因改造的结直肠癌细胞对前药5FC或GCV的敏感性，发现GCV对HSV-tk+细胞的50%抑制浓度(IC50)为对野生型细胞的1/140，而5FC对CD+细胞的IC50仅为对野生型细胞的1/960；移植瘤内如果HSV-tk+细胞少于10%，则不显示抗肿瘤效应，而CD+细胞仅需4%，实验动物肿瘤生长便受到抑制.
结直肠癌对CD/5FC更为敏感的原因可能为：①肿瘤本身对5FC具有内在敏感性；②CD/5FC系统的旁观者效应(BSE)较显著. 在此系统中，BSE不取决于细胞-细胞间接触，而取决于5FC的细胞间自由弥散. 现认为结直肠癌对HSV-tk/GCV的敏感性与癌细胞的类型有关. Link et al［43］发现在由HSV-tk+和HSV-tk-结直肠癌细胞构建的种植瘤，如果HSV-tk+细胞在全部癌细胞中占9%，在给予GCV后，发生肿瘤退缩；但某些类型HSV-tk+结直肠癌细胞对GCV呈现抗性，进一步研究发现这些细胞内HSV/tk基因部分或完全性脱落，免疫组化研究显示细胞内HSV/tk蛋白缺乏［44］. McMaster et al［45］发现三种结肠癌细胞株中有二种在HSV-tk/GCV作用期间无明显BSE发生. 分子杂交技术虽然在这些细胞测到裂隙连接蛋白connexin43，但免疫组化研究显示，这种蛋白存在于细胞浆内，而不是在细胞表面；相反，呈现强有力BSE的结直肠癌细胞表面有connexin43表达. 由于细胞表面connexin43表达是HSV-tk/GCV治疗时BSE发生的必要条件，因此某些类型结直肠癌细胞对HSV-tk/GCV缺乏敏感性［31］，可能主要与BSE不足有关，这对基因治疗方法和适合病例的选择具有实际意义.
3.3 胰癌 1994年DiMaio et al用重组逆转录病毒载体，将HSV-tk基因转染胰癌细胞. 给免疫缺陷鼠皮下注射以各种比例混合的HSV-tk+和野生型胰癌细胞，全部动物均发生胰癌. 给予GCV后，肿瘤明显消退，即使仅含10% HSV-tk+细胞的肿瘤也显示瘤体积明显缩小. 应用CEA基因作为启动子，可提高病毒载体将目的基因转入产CEA性胰癌细胞的耙向性. Ohashi et al［46］发现，用表达HSV-tk基因的腺病毒载体转染胰癌细胞时，如采用一般的启动子，则癌细胞对GCV的敏感性与CEA产生无关，如果采用CEA启动子，则GCV杀伤作用在产CEA细胞明显增强. 在胰癌的自杀基因/前药治疗中，BSE甚为显著. Green et al［24］应用硝基还原酶ND/CB1954系统，发现胰癌细胞转染ND基因后，对CB1954的敏感性提高500倍，在与野生型细胞混合培养中，只要10%的胰癌细胞表达ND，即足以引起强大BSE. 对于腹腔转移性胰癌，腹腔内输注表达自杀基因的病毒载体，往往可有效地诱发BSE. Rosenfeld et al［47］给BALB/c裸鼠腹腔内注入胰癌细胞诱发肿瘤形成，再注入表达HSV-tk基因的腺病毒载体，在注射GCV后，肿瘤明显退缩，伴有强大BSE出现. Aoki et al［48］作过类似实验， 但采用脂质体作为载体，将HSV-tk基因注入腹腔，对照组24只鼠全部出现胰肿瘤伴腹腔播散，而治疗组14只鼠中8只未见肿瘤生长.
3.4 胃癌 Yoshida et al［49］将包装有HSV-tk基因的逆转录病毒转染胃癌细胞，发现这种细胞对GCV呈现剂量和时间依赖性反应，在体外实验中低至0.1μg/mL的GCV即可将胃癌细胞杀灭；在13只皮下接种HSV-tk+胃癌细胞的裸鼠中，12只的肿瘤在给予GCV后显著退缩. 与结直肠癌相似，胃癌对HSV-tk/GCV的敏感性也以产CEA细胞最高. Tanaka et al［50］应用含CEA启动子的重组逆转录病毒转染HSV-tk基因，发现腹腔注射这种重组逆转录病毒后，30%产CEA性胃癌细胞选择性表达HSV-tk基因，给予GCV后，肿瘤生长较未给予GCV的对照组减少20%. 类似地，如果以CEA基因作为启动子，腺病毒载体也可将CD基因选择性转染于CEA阳性胃癌细胞. 有人认为，腹腔内注射以CEA基因作为启动子的腺病毒介导的CD/5FU，可能是治疗播散性胃癌的新途径.
4 问题和前景
4.1 安全性 由于本身无毒性的前药，仅在表达自杀基因的瘤细胞内才被转化为活性物质，引起后者局部高浓度，因此，在理论上，本疗法不会引起全身性副作用. 动物实验证明这种疗法是安全的. 临床Ⅰ/Ⅱ期试验同样显示本疗法不会引起严重的副作用. Klatzmann et al用鼠细胞包装表达HSV-tk基因的逆转录病毒，然后将这种鼠细胞注入黑素瘤瘤体内，每次108～3×109细胞，共1次～3次，然后给予GCV 5mg/kg，2次/d，共14d. 共治疗8例患者. 治疗后3d～9d于注射局部发生炎症反应，多数持续几天后消失；伴中等度发热，持续24h后自退. 无其他严重副反应. Klatzmann et al［51］在1998年又报告治疗12例复发性胶质细胞瘤的结果. 在手术切除肿瘤后，于腔壁多部位注入含有HSV-tk+逆转录病毒的鼠Mll细胞8.7×106/cm2，7d后再输注GCV 5mg/kg，2次/d共14d. 未见明显副作用，无一例因此项治疗而引发症状加剧或死亡. Sterman et al［52］报告胸腔内注射含HSV-tk基因的腺病毒载体，每次1012pfu，共治疗12例胸膜间皮瘤患者. 多数患者在6h～12h内轻度发热，48h～72h后消退，1例出现急性胸膜炎症状. 无明显血液学异常. 胸腔插管周围常发生皮疹，但不治而愈.
病毒载体可否在体内重新获得复制能力，而引发播散性病毒感染自杀基因能否转染非靶细胞，而引起各脏器损害目前的资料均持否定的看法. Klatzmann et al［51］曾在治疗的1例患者中测到HSV-tk基因，但为一过性，未引起不良后果. 值得注意的是自杀基因疗法治疗肝癌，对肝功能有无影响尚有不同看法. Qian et al［53］发现在二乙基硝胺(DENA)诱发的鼠肝癌，HSV-tk/GCV治疗后，在肿瘤退缩的同时，血清转氨酶明显升高，肝组织呈弥漫性损害. 但这可能由于DENA诱发的细胞增生，不仅见于肝癌结节，也发生于非癌性肝实质，以致非肿瘤性细胞也被HSV-tk基因转染，而对GCV呈现敏感性. van de Eb et al［54］报告正常的非有丝分裂肝细胞能被表达HSV-tk的腺病毒载体转染，以致在HSV-tk/GCV 治疗后可发生严重肝功能异常. 但其他学者则认为该疗法对肝无明显副作用，肝癌组织内发生的旁观者效应不会波及肿瘤外肝组织.
4.2 展望 自杀基因/前药疗法可使前药在表达自杀基因的肿瘤内，转为高效毒性物质，通过直接细胞毒性或旁观者效应发挥抗肿瘤作用. 如果基因靶向表达能够实现，则不仅正常组织免受损伤，而且可清除无法手术切除的癌灶或转移灶. 但迄今为止，该疗法主要尚处于临床前试验阶段，仅有少数进入临床Ⅰ/Ⅱ期试验，疗效也难称满意. 提高疗效的关键看来是真正做到靶向表达. 虽然某些肿瘤特异性启动子驱动的自杀基因可转染特殊瘤细胞内，但这种特异性是相对的，也可转染正常细胞；而且，病毒载体在肿瘤组织内不可能均匀分布，更不可能转染每个肿瘤细胞. 为了提高靶向性，有人主张采用复制型而不采用免疫缺陷性病毒载体，认为前者可在肿瘤内形成次级循环感染(secondary round of infection)［1］，提高转染效果；也有人主张采用不同的病毒载体，以转染不同类型的肿瘤组织或同一类型肿瘤的不同细胞. 由于病毒载体引入机体后，可诱发抗病毒抗体，而影响病毒载体的转染效果，因此采用不同的病毒载体尚有可能进行反复治疗.
努力提高旁观者效应(BSE)，对增强自杀基因/前药疗效有重要意义. 自杀基因/前药系统不同，BSE的机制也可不同，例如HSV-tk/GCV系统的BSE有赖于细胞裂隙连接的表达，而某些肿瘤不表达或甚少表达裂隙连接，显然不适于HSV-tk/GCV疗法，因此，筛选适合某一疗法的肿瘤甚为重要；也可应用药物促进裂隙连接的表达. 前药的选择也很重要，应发展新的半寿期长的高效前药，并探讨最适剂量和给药方式. 此外，联合应用不同的自杀基因/前药系统，将自杀基因和细胞因子基因联合转染入肿瘤，或联合应用常规抗癌疗法或免疫促进因子，以形成叠加杀伤效应，等，均是目前正在研究的课题. 相信在不远的将来，自杀基因疗法一定会有新的突破.
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