第五部分 其它免疫学试验
实验一 结核菌素试验
【原理】
结核菌素试验是最常用的迟发型超敏反应皮肤试验，是体内测定机体细胞免疫功能状态的方法之一。结核菌素是结核杆菌的菌体成分，注入机体后，如受试者曾经受过结核杆菌的感染，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，释放淋巴因子，在注射局部形成迟发型超敏反应性炎症，出现红肿、硬结。如受试者未受过结核杆菌的感染或未接种过BCG，则无超敏反应发生。故结核菌素试验可用来测定机体是否有过结核杆菌的感染或BCG的接种效果，亦可用于检测机体的细胞免疫功能状态。此外用动物检查结核标本时，在接种前或后也常用此试验来测定动物对结核杆菌的感染状况。
【材料】
豚鼠（约250克)、旧结核菌素、注射器、碘酒、酒精、针头等。
【方法】
1．取白色豚鼠（约250克)，从皮下接种卡介苗1～2次，一个月后取同一豚鼠，剃去腹部一部分毛，用碘酒、酒精消毒后，于皮内注射0.1毫升1∶1000稀释的结核菌素。
2．注射后72h观察结果。
【结果】
注射部位有红肿、硬结，其直径超过1cm时，即为阳性反应；无任何变化者，则为阴性反应。
【注意事项】
1．本试验不宜用于结核活动期患者，特别是结核活动期婴幼儿。
2．常规试验阴性者，可分别再用1∶1000、1∶100旧结核菌素作皮试，若仍为阴性者方可判断为阴性反应。
【思考题】
为什么结核菌素试验可用于检测机体的细胞免疫功能状态？
实验二 实验动物过敏症
实验动物过敏症属于Ι型超敏反应，与临床常见的青霉素和异种动物血清引起的过敏性休克相似，通过实验可进一步加深对Ι型超敏反应机理的理解，提高医护人员对人类过敏性休克重要性的认识。
【原理】
先给动物注射异种蛋白，经过一定时间后，动物产生的IgE类抗体结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上，动物处于致敏状态。当第二次给动物注射较大量相同抗原时，抗原与IgE结合，导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放活性介质，作用于效应器官，产生严重的过敏性休克。
【材料】
1．动物 豚鼠（250克左右)。
2．抗原 人血清、鸡蛋清。
3．无菌注射器、针头、碘酒、酒精等。
【方法】
1．取健康豚鼠2只，以 甲、乙编号，分别从甲、乙2 只豚鼠的腹腔或皮下注射1∶10稀释的人血清0.1毫升，使动物致敏。
2．致敏后14～21d，取甲豚鼠给以心脏注射未稀释的人血清1～2毫升，乙豚鼠给以心脏注射未稀释的鸡蛋清1～2毫升。
3．注射后，1～5分钟观察动物的状态。
【结果】
1．注射人血清者经几分钟后，即出现烦燥不安，抓鼻、耸毛、咳嗽、打喷嚏等现象，继而发生呼吸困难、大小便失禁，全身倒向一侧，休克死亡。而注射鸡蛋清者无任何症状出现。
2．豚鼠解剖观察肺脏的变化，可见甲豚鼠肺脏极度气肿，而乙豚鼠
肺脏正常。
【注意事项】
1．致敏途经除皮下外，还可以釆用腹腔免疫，一般在注射后2～3周，动物即可达到高致敏状态，并可维持几个月。在此期间用相同抗原进行再次注射时，可引起休克反应。
2．作抗原再次注射时，应采用静脉或心内注射的途径，使抗原直接进入循环，才能引起明显的休克反应，如采用腹腔或皮下注射，只能产生延缓性休克，甚至不发生休克反应。
【思考题】
结合动物实验，解释Ι型超敏反应发生的机理，并说明为什么乙豚鼠无超敏反应发生？
实验三 溶血空斑试验
【原理】
溶血空斑试验(Plaque Forming Cell assay， PFC试验)，是体外检查和计数产生IgM(直接法)和其他类型Ig(间接法)的抗体生成细胞的一种方法。具有特异性高、筛检力强、能直接观察等优点，可作为判断机体体液免疫功能的指标之一。直接法是取经SRBC免疫后第4天的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液后，加入SRBC和补体一起混匀于琼脂糖液中，于37℃温育后，淋巴细胞释放溶血素(抗SRBC抗体)，溶血素与周围的SRBC结合，在补体参与下导致细胞周围的SRBC溶解，在淋巴细胞周围形成一个肉眼可见的透明溶血圈(溶血空斑)。间接法是在脾细胞(约免疫l0d后)，SRBC和补体反应系统中再加入高度特异性的抗Ig类血清，例如要检测IgG抗体生成细胞则要加入抗鼠IgG抗血清，其余操作均同直接法。本试验仅介绍直接法。
【材料】
1．20%SRBC悬液(用Hanks液配制)。
2．补体 新鲜豚鼠血清(用前经靶细胞吸收，l ml压积SRBC加20ml补体，充分混匀，而后置4℃20min吸收，离心1000rpm，10min，取上清，用Hanks液稀释为l∶10)。
3．右旋糖酐(DEAE－dextran，分子量50万，用蒸馏水配制成l0mg／m1，阻止琼脂的抗补体作用)。
4．琼脂或琼脂糖(表层基0.7%，底层基1.4%用Hanks配制)。
5．胎牛血清(56℃30min灭活，并经羊红细胞吸收)。
6．Hanks液。
7．水浴箱调至47～49℃。
8www.med126.com．1ml注射器和青霉素小瓶。
9．玻璃平皿(7×1.5cm)。
10．动物 体重18～25g的纯系小鼠。
11．0.5%台盼蓝染液。
12．其他器材 剪刀、镊子、解剖板、血球计数板、注射器、纱布、试管等。
【方法】
1．将溶化的底层琼脂倾注平皿内，成一薄层，待凝固备用。
2．将每管含2ml表层基的试管加热融化后，放47～49℃水浴保温。
3．SRBC悬液的制备
以无菌操作抽取绵羊血。保存于阿氏(Alsevers)液内，置4℃保存，一般不超过2周。实验时取保存的羊血，用生理盐水洗涤三次，每次离心2000rpm，5min，制成SRBC悬液，计数，然后按实验需要配制成20%及2×109／ml的红细胞悬液。
4．免疫小鼠脾细胞悬液的制备
⑴ SRBC免疫小鼠 最好用纯系鼠，体重25g左右，腹腔注射绵羊红细胞（2×109个／m1)0.5ml或尾静脉注射0.2ml。测定直接溶血空斑，用免疫后4d的鼠；测定间接溶血空斑，用免疫后10d的鼠。
⑵ 将免疫小鼠拉脱颈椎致死。暴露腹腔，取出脾脏放在周围有碎冰块的小瓶内，先用1ml注射器尖端将其捣碎，再加冷Hanks液数毫升，用注射器抽吸吹打，使细胞分散均匀。经尼龙布(或八层纱布)过滤离心去上清，将细胞用冷Hanks液洗涤两次，再将沉淀的细胞重悬于1ml冷Hanks液内，置冰浴中。
⑶ 脾细胞用白细胞计数法计数并用台盼蓝检查活细胞的百分率。脾细胞制成5～10×107细胞／ml；另取少量脾细胞悬液与等量0.5%台盼蓝混匀，静置数分钟，计数核被染色死细胞的百分数，从总细胞数中将死细胞数扣除。
5．试验平皿的制备 将底层平皿和所有试剂(除脾细胞外)预温40℃左右。于水浴内保温之表层基中加入以下各试剂：⑴胎牛血清0.1ml；⑵右旋糖酐(10mg／m1)0.1ml(用琼脂糖时不用此试剂)；⑶20%SRBC悬液0.1ml；⑷脾细胞悬液(5～l0×106细胞／m1)0.1ml。迅速将小试管夹于两手掌间旋转混匀，倾注于铺有底层之平皿内，避免倾入气泡。在水平台上使表层基铺平，凝固后，放37℃孵育1h。然后于每个平皿内加1∶l0稀释的补体1.5～2ml，使均匀覆盖其表面，再次孵育30min，即可用肉眼或放大镜观察溶血空斑，并计数。
【结果】
将平皿划分小格，用放大镜观察并计数溶血空斑总数，再换算出每百万脾细胞中所含抗体形成细胞数。如用于药物筛选，可比较给药组和对照组每百万脾细胞(1×106)中抗体形成细胞数的平均值，以表示药物的刺激作用或抑制作用。
【注意事项】
1．绵羊红细胞最好用新鲜脱纤维的SRBC。洗涤SRBC时，离心速度以2000rpm，10min为宜，不超过三次。用前镜检如有变形，表示脆性增大，不宜采用。
2．SRBC可大致计数，但脾细胞计数必须准确。
3．免疫动物必须用纯系动物，杂种动物个体差异大，难以比较。最好先作几次预试验，使每个平皿空斑数控制在100～150个左右为宜。
4．补体浓度以l∶10为宜，无需经过滴定。但若用琼脂铺板时则补体原液不必稀释，以阻止琼脂的抗补体作用。
5．所有器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温，并在水平台上操作。
6．离体的脾细胞应不离冰浴，防止细胞死亡。
【思考题】
1．简述溶血空斑试验的原理及其实际应用。
2．在本试验中，绵羊红细胞有什么作用？
实验四 生物制品
用于人工免疫的抗原、免疫血清、免疫细胞和免疫分子制剂，以及诊断用的生物制剂统称为生物制品(biologic product)。生物制品主要分为三类，即预防接种制品、治疗制品和诊断用品。
一、预防接种制品
国内常将由细菌、螺旋体制备的用于人工自动免疫的生物制品称为菌苗，而将由病毒、立克次体等制备的用于人工自动免疫的生物制品称为疫苗。国际上常将其统称为疫苗。
(一) 菌苗类
1．死菌苗 霍乱菌苗、伤寒菌苗，伤寒、副伤寒甲、乙三联菌苗，霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙四联菌苗，百日咳菌苗等。
2．活菌苗 卡介苗(BCG)、鼠疫活菌苗。
（二)疫苗类
1．死疫苗 流行性乙型脑炎鼠脑疫苗、鸡胚疫苗、组织培养疫苗、斑疹伤寒鼠肺疫苗。
2．活疫苗 脊髓灰质炎减毒活疫苗。
3．类毒素类
由细菌外毒素制备的人工自动免疫制品称为类毒素，如白喉类毒素、精制磷酸铝吸附白喉类毒素、破伤风类毒素、精制磷酸铝吸附破伤风类毒素等。
4．混合制品类
百日咳菌苗和白喉类毒素混合制品，百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制品。
二、治疗制品
（一)抗毒素
用类毒素免疫动物获得的人工被动免疫制品称为抗毒素。如精制白喉抗毒素、精制破伤风抗毒素、干燥粉剂破伤风抗毒素。
（二)其它免疫血清制品
胎盘球蛋白、丙种球蛋白、抗麻疹人血清、抗淋巴细胞血清(anti-lymphocyteserum， ALS)、 抗淋巴细胞丙种球蛋白(anti-lymphocyte γ globulin， ALG)等。
（三)免疫细胞和免疫分子制剂
转移因子（transfer factor，TF)、免疫核糖核酸(immune RNA，iRNA)、胸腺素(thymosin)等。
三、诊断用品
（一)旧结核菌素(old tuberculin，OT)和精制结核蛋白衍生物(purified protein der中国卫生人才网ivative，PPD)。
（二)锡克氏毒素（Schick’s toxin)、狄克氏毒素(Dick’s toxin)。
（三)诊断菌液 变形杆菌OX19、OXK 等菌液。
（四)诊断血清 沙门氏菌属因子血清，志贺氏菌属因子血清，甲胎蛋白诊断血清，羊抗人IgG、IgA、IgM诊断血清等。
【思考题】
1．常用于预防接种和免疫治疗的生物制品有哪些？其应用原理与原则如何？
2．什么是人工主动免疫和人工被动免疫？
