第3章  细菌毒素

这4种毒素的氨基酸序列已经确定，但功能区分布仍不清楚。巯基活化毒素肽链C端都有一个非常保守的12肽段，其内有1个Cys（图3-5)。由于只有1个Cys，毒素没有肽链内二硫键；毒素聚合时这个Cys既不与邻近毒素的Cys连接，也不与其它毒素或靶细胞膜蛋白连接，所以Cys上有1个游离“-SH（巯基)”。

图3-5  巯基活化溶细胞毒素C端的高度保守12肽段

毒素C端可能是R区，并起着稳定肽链空间构象的重要作用，其中12肽段很可能就是结合部位。而肽链中段大约每3～4aa就交替显示亲水性或疏水性，其中大约30aa形成的两性α螺旋结构，是衬在聚合体跨膜孔亲水性内腔的，表明中段是毒素的T区。

RTX家族  如大肠埃希菌溶血素A（hemolysin，HlyA)。RTX（repeat-in-toxin)家族是许多革兰阴性菌产生的一类独特的单肽链毒素，其共同特点是：①肽链C端有若干个保守的“富含甘氨酸和天冬氨酸九肽重复序列”（GD-rich nonapeptide sequence)，故命名为“RTX”；②需要一种翻译后成熟机制，即通过共价酰胺键将脂肪酸连接至肽链内赖氨酸残基上才能激活。

大肠埃希菌首先合成的是无活性的溶血素A前体（pro-HlyA)，其N端有1个高度保守区段，即跨膜区，由4个强两性α螺旋构成，可以插入细胞膜形成跨膜孔；中段为活化区，含2个独立的酰基转移酶识别区，每个区内各有1个赖氨酸酰化靶位（K1和K2)；C端为GD九肽重复序列区，可识别并结合靶细胞膜受体（图3-6)。

大肠埃希菌溶血素C（HlyC)可利用肉豆蔻酰-酰基载体蛋白，给pro-HlyA的K⁵⁶⁴和K⁶⁹⁰以共价酰胺键各连接1个肉豆蔻酸分子，使HlyA获得最大溶血活性。成熟的HlyA分泌出菌体后，必须与Ca²⁺结合后才能和受体结合。RTX的C端一般有8～18个GD九肽重复序列拷贝，每个重复序列可结合1个Ca²⁺，然后形成短β-片层，构成“弹簧”样的β环。β环本身不能插入靶细胞膜，但它们能促成毒素不可逆地插进膜内。

图3-6  RTX毒素分子结构示意图

百日咳杆菌腺苷化酶毒素（adenylatecyclase toxin，CyaA)与其它RTX不同（图3-6)，主要表现在：①CyaA的N端多了1个腺苷环化酶活性区；②在酶活性区末开始的一段肽链中，含有14个“丙氨酸重复序列”（ASAAAGAVAAAXG)，参与构成跨膜区，可以协助酶活性区进入靶细胞；③C端的GD九肽重复序列特别多，有38个拷贝；④当CyaA在百日咳杆菌细胞浆内合成时，一般由棕榈酸酰化K⁹⁸³即可激活；当CyaA在大肠埃希菌中表达时，则需K⁸⁶⁰和K⁹⁸³均被酰化后才被活化。

三、多肽毒素

大肠埃希菌耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST)肽链一般只有15～50aa，其中一大半是保守序列。保守区具有毒素的完全毒性，其内有6个Cys，形成3个二硫键，构成一个有3个β-转角的右手螺旋结构，其第二转角区内的“CNPAC”极端保守，可能是受体结合部位，对毒素活性影响最大。

第三节  细菌毒素的作用机制

细菌毒素一般至少有二个功能区，一是靶细胞膜受体结合区，决定毒素对靶细胞的特异性并介导毒素进入细胞；另一个是活性区，它选择“靶点”，决定毒力强弱和作用机制，具有膜穿孔或酶活性，并引起相应临床症状。

细菌毒素的特定作用对象称为“靶点”，它可以是某种细胞、细胞器、酶或其他大分子物质，例如，志贺毒素作用于核糖体60S亚基，霍乱肠毒素作用于G蛋白，膜损伤毒素作用于细胞膜。毒素要发挥毒性必须到达靶点，这一过程大致分四步完成：①毒素结合区与敏感细胞的相应膜受体结合；②毒素进入细胞或毒素信号导入细胞；③毒素到达靶点；④毒素激活、修饰或改变靶点。

一、毒素进入靶细胞的一般机制

（一)毒素与靶细胞膜受体结合

细菌毒素与靶细胞膜上相应受体结合是发挥毒性作用的第一步。毒素引起宿主何种临床症状，首先取决于细菌的定植部位及毒素受体。例如，霍乱肠毒素（CT)的受体是神经节苷脂GM1，而GM1几乎存在于所有的哺乳动物细胞膜上，理论上CT应可以引起全身各种器官的疾病。但由于自然感染的霍乱弧菌定植局限于小肠粘膜表面，其分泌的CT亦受限制，只能与小肠粘膜上皮细胞膜的GM1分子结合，因此仅引起以水样腹泻为主的霍乱症状。

毒素受体是一类能与相应毒素特异结合，并能介导毒素（或毒素信号)进入细胞内的膜分子，如蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱等（表3-1)。受体应具有以下特点：①特异性：受体与毒素有特异对应性；②高亲和性：受体与毒素结合能力较强，一般是分子空间构象互补吻合，具有不可逆性。当然，也有低亲和性受体；③效应性：受体能介导毒素内在化，或传递毒素信息。

细菌毒素只有1个受体结合区，故1个毒素分子一般只与1个受体分子结合，但梭菌神经毒素（CNTs)比较特别。研究表明，CNT 的H_C-N可与蛋白或糖蛋白分子结合，若其C端缺失10aa，毒素就不能与脊髓神经元结合；而H_C-C的C端最后34aa发生变异，毒素亦不能与GD1b或GT1b等膜分子结合，这提示CNT可能采用双受体模式与神经元结合。已有动物实验证实，肉毒毒素B/E在多唾液酸神经节苷脂存在时，均可与突触体上的synaptotagminⅡ蛋白强力结合，这提示CNT到达神经肌肉接头后，H_C-C可与神经末梢突触前膜上的GD1b等低亲和性结合，然后H_C-N再与膜蛋白高亲和性结合，介导毒素分子内在化进入神经元。

毒素与膜受体的特异性结合具有空间构象互补性，如CT-B₅与GM1结合的微结构是一个疏水性袋状结构，由一个B链分子的Ile⁵⁸和Trp⁸⁸与相邻B链分子的Lys³⁴构成，GM1糖链上最末一个半乳糖直接锚合在这个疏水性“口袋”内，这种空间构象的吻合使CT不可逆地结合在靶细胞膜表面（图3-12)。

（二)细菌毒素的入胞及转运机制

入胞方式  细菌毒素与膜受体特异结合后，可通过以下方式进入细胞（图3-1)：

1．穿膜进入  在电镜下观察到，一些有明显三功能区的毒素，如DT、TeNT等，在低pH条件下，毒素R区与膜受体结合后，其T区可在脂质双层膜上形成所谓“毒素离子通道”，足以使未折迭的C区经通道穿膜进入细胞内。

2．越膜控制  具有越膜控制方式的毒素与膜受体结合后，不进入细胞，而是通过受体分子构型的改变，引起细胞表面调节装置改变或激活膜内镶嵌的酶分子，将毒素携带的生物信号传递至细胞内，进而调控细胞内的相关代谢反应。如大肠埃希菌耐热肠毒素（ST)的受体可能是鸟苷环化酶C，ST一旦与之结合则激活此酶，导致靶细胞合成cGMP。

3．内在化（internalization)  是指细菌毒素与相应受体结合后，依靠受体介导的内吞作用（receptor mediated endocytosis，RME)进入细胞。几乎所有的真核细胞膜上都有一种特殊的“内吞细胞器”，称为膜小泡（coated vesicles)或笼型蛋白（clathrin)，其功能与细胞膜和内质网、高尔基体等之间的物质转运有关。

毒素的REM过程  细菌毒素依靠RME进入细胞的过程比较复杂（图3-1)。

1．白喉毒素  B链与靶细胞膜受体pro-hHB-EGF的微结构（由Phe¹¹⁵、Leu¹²⁷和Glu¹⁴¹构成)结合后，多个DT分子聚集成寡聚体，再被内吞进入内体（endosome)。一般情况下，含有异物的内体将被酸化，内体内的酸性环境（pH5.2～5.8)使DT的B链发生构象改变而暴露跨膜区（T)区，于是B链聚合体的α8/9螺旋结构插入内体膜内，α1也随后插入，形成跨膜通道，使A链穿过内体膜，连接A-B的二硫键突出于细胞质中，被酶水解，A链得以进入宿主细胞质内（图3-7)。

图3-7  白喉毒素穿过内体进入细胞质示意图

2．霍乱肠毒素   B链与小肠粘膜上皮细胞膜神经节苷脂GM1受体结合后，GM1在膜上横向移位，使CT-GM1复合体簇集在膜的小凹内，然后质膜收缩内陷，内在化形成一个膜小泡或内体。膜小泡通过膜小泡通道转运进入高尔基体，最终到达内质网。在高尔基体或内质网内，CT-A与B₅解离，依靠A2锚接在内质网膜上。内质网内有二硫键异构酶，可催化A1与A2解离，A1穿过内质网膜进入细胞质内的作用靶位（图3-8)。

图3-8  霍乱肠毒素进入细胞质示意图

3．炭疽毒素  炭疽毒素的保护性抗原PA83（83kDa)通过C端与靶细胞膜受体结合，随后被宿主细胞蛋白酶在其N端¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷位点处水解，切去1个20kDa的片段（PA20)，保留63kDa肽链（PA63)，并暴露与致死因子（LF)和水肿因子（EF)高亲和性结合的位点，可以与1条LF或EF肽链结合。7分子PA63聚合形成中空的环形七聚体前期小孔（prepore)，与LF或EF结合后，经RME过程进入内体。在内体的酸性环境中，PA63构象改变，插入内体膜中，形成内径为2nm的跨膜离子通道，将连接在七聚体上的7分子LF或EF转递入胞浆内（图3-9)。

图3-9  炭疽毒素入胞方式和作用机制

4．破伤风痉挛毒素与肉毒毒素  破伤风痉挛毒素（TeNT)与肉毒毒素（BoNTs)的结构、受体及酶活性机制非常相似，但临床症状却大不相同。TeNT主要通过阻止脊髓前角抑制性中间神经元释放抑制性神经介质（甘氨酸和γ氨基丁酸)，使运动神经元持续兴奋而导致骨骼肌痉挛(图3-10)；而BoNTs主要通过阻止胆碱能末梢神经元释放乙酰胆碱，阻断神经冲动传递，引起神经肌肉弛缓性麻痹。

图3-10 破伤风梭菌痉挛毒素作用机制

研究表明，TeNT与BoNTs在入胞和转运时存在微妙的差异，表现在：①BoNTs结合部位在突触前神经末梢膜，而TeNT结合在突触前神经末梢终扣；②TeNT与BoNTs内在化进入神经肌肉接头后，进入不同的膜小泡。BoNTs进入酸性的内体，TeNT则进入神经元突触前囊的突触小泡（synaptic vesicles，SVs)内。因此，这二种毒素的作用靶点不同。

在内体的酸性环境中，BoNTs构象改变，暴露疏水性跨膜区，在内体膜上形成穿膜孔，释放L链进入神经元胞浆内，使BoNTs停留在外周神经肌肉接头处中，封闭神经递质的释放。而TeNT通过重链H_C识别神经肌肉结头处运动神经元外胞浆膜上的受体并与之结合，促使毒素进入细胞内由细胞膜形成的突触小泡（SVs)中。进入SVs后，由于SVs可利用生理性再循环运输神经介质等多种物质，因而可能利用SVs逆向运送TeNT。研究发现，在正在生长的海马神经元轴索中，存在自发再循环的携带金粒标记TeNT的SVs，这提示SVs可能通过交替胞饮（pinocytosis)和胞吐（exocytosis)的再循环，逐www.med126.com/yishi/级接力式转递，从外周神经末梢沿神经轴索逆行向上，将TeNT运送至脊髓前角抑制性中间神经元。在此处SVs与内体融合，通过跨膜区的穿膜孔作用，释放L链进入神经元胞浆内。

二、溶细胞机制

（一)聚合型穿孔毒素

这类毒素至少存在二种聚合方式：①单体分子在靶细胞膜外侧面上或在液相中形成聚合体（如α-Hly形成七聚体)，之后插入细胞膜导致细胞溶解；②一个单体分子先行插入细胞膜内，随后若干个单体分子紧挨先插入的毒素分子依此插入，排列成中空的跨膜聚合体，导致细胞溶解（图3-1)。例如，链球菌溶素O用数十乃至100多个单体分子聚合形成超大结构孔。这些毒素的聚合体异乎寻常的稳定，一般很难解聚。

金黄色葡萄球菌α-溶素  α-Hly单体分子可与人红细胞、白细胞、血小板、内皮细胞及家兔红细胞的细胞膜结合，结合方式有：与膜受体神经节苷脂亲和性的特异结合，或与膜脂低亲和性的非特异结合。结合后，单体分子在膜外聚合成七聚体分子后，再插入细胞膜内。

七聚体空间构象呈“蘑菇”形，由帽、茎干和7个轮缘组成（图3-10，图3-4)。帽呈七边形，直径10nm，高7nm，与膜脂质层平行。轮缘在帽下缘，向下凸出，在轮缘和茎干顶部之间有一裂缝，此处有一个碱性和芳香氨基酸富含区，可以和膜磷脂头部或其它膜受体互相作用。

7个单体分子的茎干区在装配时，聚合形成一个高5.2nm的疏水性中空桶形结构（茎干)，与氨基酸门闩区及三明治区的内面共同形成聚合体的核心，然后茎干插入靶细胞膜，形成跨膜通道。通道高约10nm，孔径1.4～4.6nm，由于孔径小，只允许离子、水和小分子物质通过，但离子外泄破坏了细胞渗透压的平衡，可导致细胞溶解死亡。

图3-10 α-Hly七聚体结构图  (左)正视图  (右)俯视图

巯基活化溶细胞毒素家族  链球菌溶素O首先是1个（或极少几个)单体分子与膜胆固醇分子结合后插入膜内，然后其它单体分子以此为基点依次插入膜内，排列成弓形。弓形聚合物形成后，可能在其相对的游离边发生“切割”，细胞膜上出现弓形损伤，最终导致规则或不规则的环形损伤。

在电镜下，可见细胞膜上出现1个由许多（70～125个)单体分子聚合形成的冠状双层大孔径跨膜孔，外层环的单体分子疏水面朝外，内层环的单体分子亲水面朝内。跨膜孔最大外径可达34nm，内径≥24nm，比α-Hly七聚体和补体攻膜复合体的跨膜孔都大，甚至允许蛋白质等大分子轻易外泄，最终导致细胞溶解。

巯基活化毒素有两个突出特点：①膜受体是胆固醇；②毒素对O₂敏感。在有游离胆固醇分子或氧存在时，毒素可失去溶血活性；若消除这两个因素，又重新恢复活性。以往对这一现象的解释是，巯基活化毒素带有一个Cys-SH，而-SH（巯基)正好对氧化作用敏感，因此，毒素的溶血性与巯基的氧化或还原有关，即在有氧状态下Cys-SH被氧化则毒素失活，在含巯基还原剂存在时被还原则毒素恢复活性。但是，近年发现，巯基活化毒素的溶血性与巯基的氧化或还原无关，原因不清。

（二)RTX家族

RTX可分为二类：①低特异性RTX，靶细胞范围广泛。如大肠埃希菌溶血素A（HlyA)几乎可以溶解各种哺乳动物细胞（如红细胞、白细胞、血小板、内皮细胞、上皮细胞等)；②高特异性RTX，靶细胞范围很窄，如放线共生放线杆菌溶血素A只溶解人和灵长类动物白细胞。

RTX可通过单分子机制形成跨膜孔，一般地，1～3个HlyA分子即可成孔，即使有寡聚化作用，也是插入膜内后单体分子附加上去的。HlyA通过静电电荷与细胞膜可逆吸附，接着C端结合区与靶细胞膜上的整合素受体不可逆结合，最后N端疏水螺旋结构插入细胞膜，形成跨膜通道，跨膜孔直径约为1nm，允许细胞外的Ca^2＋流入和细胞内的K^＋流出，从而改变细胞膜通透性，导致靶细胞溶解。

RTX以亚溶细胞浓度作用于靶细胞时，不会立即溶解细胞，但可产生多种生物学效应，如HlyA与靶细胞膜结合后，可导致细胞骨架重排及G蛋白信号转导改变，合成细胞因子（如IL-1和TNF)，释放生物活性介质（如白三烯B4)，使膜CD14分子大量脱落，脱落的CD14分子粘附在邻近的细胞膜上，使这些细胞对LPS更加敏感。

三、酶活性机制

许多细菌毒素，如霍乱肠毒素、白喉毒素、肉毒毒素、百日咳毒素、志贺毒素、炭疽毒素等具有酶活性，主要包括：

（一)ADPR转移酶

腺苷二磷酸核糖（ADPR)转移酶（ADP-ribose transferase)的A链一般具有二种酶活性，即尼克酰胺腺苷二磷酸（NAD)糖基水解酶和ADPR转移酶，前者将NAD水解为ADPR和尼克酰胺，后者则将ADPR转移到一个受体分子上去(图3-12)。NAD糖基水解酶作用机制大体相同，故毒素的毒性效应取决于ADPR转移酶所选择的ADPR受体。

霍乱肠毒素  细胞膜内侧有腺苷环化酶（adenylatecyclase，ACase)，可催化ATP转化为cAMP。ACase的活性受与其偶联的诱导性G蛋白（Gs)或抑制性G蛋白（Gi)调控（图3-12)。G蛋白由α/β/γ3个亚基组成，处于静止状态时，α/β/γ聚合在一起并与GDP结合。当诱导剂与细胞膜受体结合后，G蛋白立即与GTP结合而被激活，其α与β/γ2个亚基分离。Gsα亚基与ACase结合并使之活化；若Gi被激活，Giα与ACase结合，ACase活性受抑制。Gsα处于活化状态时，其自身的GTP水解酶活性也被激活，可缓慢催化GTP水解为GDP，逐渐使本身失活，重新与β/γ两亚基聚合，G蛋白恢复静止状态，ACase停止合成cAMP。

图3-12  CT、DT和PT催化的ADP核糖基转移反应

CT-A1具有NAD糖基水解酶活性（ADPR的受体是水分子)：

  CT-A1

NAD ＋ HOH ADPR^－ ＋ 尼克酰胺 ＋H⁺ （反应一)

CT-A1亦具精氨酸特异性ADPR转移酶活性，主要选择细胞膜内侧诱导性G蛋白的α亚基（Gsα)作为ADPR受体，将ADPR转移到Gsα-Arg¹⁷⁴上，从而激活Gs蛋白：

 CT-A1

ADPR^－ ＋ Gsα-Arg¹⁷⁴ADPR-Arg¹⁷⁴-Gsα （反应二)

细胞内有一些膜蛋白和细胞因子，如ADP核糖化因子（ADP-ribosylation factor，ARF)能促进或放大CT-A1的酶活性。目前至少已发现6种ARF，为单肽链蛋白，定位在细胞膜或高尔基体上。ARF与GTP结合后可促进CT-A1对Gsα的ADP核糖基化活性。

霍乱弧菌定居在人的小肠粘膜表面，所分泌的CT可与小肠肠腔上皮细胞微绒毛的神经节苷脂GM1分子结合，进入小肠粘膜上皮细胞后，ARF-GTP促进CT-A1水解NAD，将ADPR转移给Gsα。Gsα结合ADPR后被激活，同时又因结合了GTP，降低了本身的GTP酶活性，所以保持持续活化状态，一直与ACase结合，致使ACase持续性活化，合成大量的cAMP（图3-13)。

图3-13  霍乱毒素作用机制示意图

cAMP作为第二信使可激活细胞的许多生理功能，其中大多数生理功能是通过激活腺苷酸蛋白激酶A（APK)等，由后者促使多种靶蛋白磷酸化来表现的，可能机制之一是：小肠粘膜细胞内过量的cAMP过度激活APK，导致细胞膜内Na^＋转运相关蛋白分子磷酸化，使钠泵活性下降，小肠粘膜细胞Na^＋吸收受阻，Cl^－外流和液体分泌增加，肠腔内水潴留而引起严重腹泻（图3-12)。

白喉毒素  DT-A水解NAD后，选择肽链延长因子-2（elongationfactor 2，EF-2)为ADPR受体。EF-2分子上有一个少见的“2-[3-羧基酰胺-3-（三甲胺基)丙基]组氨酸”，即白喉酰胺（diphthamide，DA)，DT-A把ADPR转移给DA。EF-2是肽链合成转位反应所必需的酶，它与ADPR结合后失去活性，核糖体“受位”上正在合成的肽链因而不能转位至核糖体“给位”，使氨基酰-tRNA无法与核糖体结合，肽链延伸反应停止，靶细胞因不能合成蛋白质而死亡。

肉毒毒素  BoNT-C3也是ADPR转移酶，但它选择的ADPR受体是Rho蛋白。Rho蛋白属于小分子GTP酶中的Ras超家族，其主要成员有Rho-A/B/C、Rac-1/-2、Ras和Cdc42蛋白等。BoNT-C3水解NAD后专一地将ADPR转移给Rho-Asn⁴¹，使Rho蛋白失去自身的GTP酶活性，其GTP酶活性也不能被GTP酶活化蛋白（GTPaseactivating proteins，GAP)所激活，因此，Rho蛋白不能水解GTP为GDP，一直保持与GTP结合的持续活化状态。

在细胞内，Rho蛋白起着分子开关的作用，它们的持续性活化可激活Rho蛋白激酶家族的一系列酶分子，引起肌动蛋白细胞骨架解聚、改组或损伤，以及细胞内磷酸肌醇水平改变，进而影响许多细胞功能，如细胞形态、运动性、生长周期的进程、细胞胞饮或胞吐等，最终可导致细胞病变或坏死。

BoNT-C2不同于BoNT-C3，水解NAD后直接将ADPR转移给受Rho蛋白影响的G-(β/γ)-肌动蛋白-Arg¹⁷⁷（不是G-α-肌动蛋白)，影响肌动蛋白的聚合及细胞骨架的构架。

综上所述，ADPR转移酶毒素的NAD糖基水解酶活性基本相同，但选择的ADPR受体可以不同，因此，ADPR转移毒素具有多种多样的毒性效应。迄今至少已发现4类ADPR的受体：G蛋白、EF-2、Rho蛋白和肌动蛋白（表3-2)。

表3-2  细菌毒素的基团转移酶活性

（二)葡萄糖基转移酶（glycosyl-transferase)

大梭菌细胞毒素家族（LCTs)作用的靶点也是Rho蛋白，但底物不是NAD。TcdA、TcdB和TcsL可利用尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc)为底物，水解UDP-Glc后，将葡萄糖基特异性地转移给Rho-Thr等。Tcnα则利用尿苷二磷酸氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)为底物，将UDP- GlcNAc水解后，将氨基葡萄糖基特异性地转移给Rho-Thr等（表3-2)。Rho蛋白糖基化后，一直保持与GTP结合的持续活化状态，最终导致肌动蛋白细胞骨架改组或损伤等。

（三)脱嘌呤酶（depurinase)

志贺毒素（ST)和志贺样毒素（SLT)具有相同的RNA-N-糖苷酶活性，底物是真核细胞核糖体60S亚基的28SrRNA，可水解28S rRNA 5＇端4 324位腺嘌呤的N-糖苷键，该腺嘌呤脱落使60S亚基失活，依赖EF-1的氨基酰化tRNA不能与其结合，致使蛋白质合成停止，靶细胞死亡。

（四)脱酰胺酶（deamidase)

大肠埃希菌可以产生一种作用于Rho蛋白的毒素，即细胞毒性坏死因子（cytotoxicnecrotizing factors，CNFs)。当在Vero细胞培养液中加入CNF1后，CNF1进入细胞，表现出脱酰胺酶活性，专一地将Rho-Gln⁶³脱酰胺变成Rho-Glu⁶³，Rho蛋白因而失去GTP酶活性，保持其持续活化状态，导致肌动蛋白细胞骨架改组、肌动蛋白应激纤维聚集和细胞坏死等多种生理和病理现象。

（五)锌内肽酶（zine endopeptidase)

梭菌神经毒素  靶分子是神经元膜内的小突触泡蛋白（synaptobrevin)。毒素可切割、降解储存有神经介质的小突触泡蛋白特异性肽键，使小泡膜蛋白发生改变，从而阻止神经介质的释放。

1．神经胞吐过程  在N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF)调控下，可溶性NSF附着蛋白(soluble NSF-attachm医学考研网ent protein，SNAP)与一组保守的“SNAP受体”（SNAPreceptors，SNAREs)的聚合及解聚在神经胞吐过程中起着关键作用。SNAREs主要成员有：

（1)小突触泡蛋白：又称为小泡相关性膜蛋白（vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)，位于突触小泡（SV)膜上。如人和大鼠的VAMP2，其C端穿膜进入SVs泡内，N端暴露于SV外的神经元胞浆内。

（2)衔接素（syntaxin，SYN)：位于突触前膜上，如大鼠SYN1A，其C端插入突触前膜内，N端游离于神经元胞浆内。

（3)突触小体相关蛋白（synaptosomal-associatedprotein，SNAP-25)：它没有跨膜区，在肽链中部有4个Cys，Cys被棕榈酸酰化后，依靠棕榈酸分子锚在突触前膜的脂类分子上。

当神经元受刺激后，其突触前囊内的SVs向突触前膜移动，随后VAMP2中段的α-螺旋与SYN1近膜端的α-螺旋和SNAP-25B的N端及C端各一个α-螺旋紧紧缠绕结合，形成一种卷曲线圈结构（coiled-coil structure)，称为“核心复合体”（corecomplexs)，然后与SNAP形成一个高度稳定的20S四聚体。由于螺旋状核心复合体的“拉紧”作用，促使SVs与突触前膜对接并融合，融合后即可发生Ca^2＋调节的胞吐作用，SVs将泡内的神经介质释放进入突触裂中。最后NSF与四聚体中的SNAP结合。NSF是一种ATP酶，它可催化四聚体解聚，使SVs与突触前膜解离进入下一轮再循环（图3-14)。

2．梭菌神经毒素的酶活性  梭菌神经毒素（CNTs)是锌内肽酶，底物是SNAREs，每一种毒素（除BoNT-C1外)只水解1种SNAREs肽链上的1个肽键。CNTs在人或大鼠SNAREs肽链上的酶切位点已基本清楚，均在形成核心复合体的保守α-螺旋肽段内，如VAMP2的α-螺旋肽段内有4个CNTs的酶切位点（图3-15)。

大量的实验证据表明，CNTs水解任何一种SNAREs肽链，核心复合体便不能形成，从而阻止SVs与突触前膜融合及SVs释放神经介质，即阻止神经传导。

炭疽毒素  有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导途径是哺乳动物细胞在进化上古老而保守的细胞内信号途径，该途径主要参与调控胚胎早期发育、细胞增殖和分化、细胞形态等，是细胞成熟促进因子(如细胞周期蛋白B/p34^cdc2激酶)活化及细胞继续减数分裂的必经途径。MAPKs途径由MAPK激酶1和2（MAPKkinase 1&2，MAPKK1&2)激活，MAPKK1&2是参与调控细胞形态和增殖的关键分子，而其N末端在调控MAPKs信号转导过程中尤为重要。

炭疽毒素致死因子（LF)可抑制MAPKs信号转导通路。LF（776aa)N端与PA63结合后，经RME进入靶细胞浆内，其C端有1个Zn^2＋结合位点，具有锌内肽酶活性，其底物是MAPKK1&2，酶切位点是MAPKK1-N端⁷P-I⁸和MAPKK2-N端⁹P-I¹⁰。LF进入靶细胞内后，可切除MAPKK1-N端7aa和MAPKK2-N端9aa，从而阻止MAPKK1/2与它的底物MAPKs相连接，使MAPKs途径不能活化。因此，LF的毒性主要表现为诱导靶细胞形态学改变、阻止静止细胞进入S期，最终导致细胞死亡（图3-9)。

（六)腺苷环化酶（adenylate cyclase)

炭疽毒素水肿因子（EF)肽链N末端与PA63结合并经RME进入靶细胞浆内后，其C端具有钙调节蛋白依赖性腺苷环化酶活性，可在细胞内直接催化合成第二信使cAMP，扰乱细胞调控机制，引起一系列细胞毒效应，最终导致细胞死亡（图3-9)。

百日咳杆菌CyaA溶血活性很弱。CyaA与靶细胞膜受体结合后，跨膜区插入细胞膜，将酶活性区转膜进入细胞内。酶活性区具有依赖Ca^2＋的腺苷环化酶活性，可在细胞内直接催化合成cAMP，引起一系列细胞毒效应，最终使细胞死亡。

第四节  超抗原

超抗原（superantigen，SAg)的概念最早由White于1989年提出，它是一类具有多种免疫活性的蛋白分子，由某些细菌、病毒、支原体等产生，故涉及到免疫学、医学微生物学和传染病学等范畴。了解细菌超抗原的生物学特性，有助于阐明其产生菌所致疾病的免疫学发病机制。

一、特   点

与普通抗原（conventionalantigen)相比，细菌毒素超抗原具有以下显著特点：

1．只需极低浓度（1-10ng/ml)即可刺激强烈的初次免疫应答，可激活的T淋巴细胞的数量比普通抗原多达数千倍，且没有初次和再次免疫应答的区别，故称为超抗原。而普通抗原必须在体内引导（priming)和加强（boosting)后，才能在体外检测到T细胞增殖反应。

2．不经抗原提呈细胞（antigenpresenting cells，APC)加工处理，可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHCⅡ类分子及T细胞受体（T cell receptor，TCR)Vβ区非特异性结合，激活T细胞增殖。而普通抗原则需经APC降解成短肽后，才能提呈于MHCⅡ类分子肽链结合的沟槽内。

图3-15  超抗原与TCRMHC-Ⅱ分子结合示意图

3．结合部位不在抗原肽结合的沟槽内，而在沟槽外侧。具有双结合功能，能同时与APC膜上的MHC-Ⅱ-α/β链及T细胞膜上的TCR-β链可变区（Vβ)结合（图3-15)，一般一种SAg只选择性地激活某些Vβ类型的T细胞克隆。

4．与TCR结合时，只涉及TCR Vβ的抗原受体互补决定区（CDR)2和CDR1，不涉及Vβ的CDR3和TCRα的识别，故T细胞对超抗原的反应不受MHCⅡ类分子的限制，这违背MHC限制的“黄金规则”（thegolden rule of mhc restriction)。普通抗原特异细胞反应都受MHC限制。

二、分   类

超抗原（SAg)由某些细菌、病毒（如人类免疫缺陷病毒、鼠乳腺瘤病毒、狂犬病病毒、EB病毒)和支原体产生。根据产生菌、作用靶细胞、分子结构特点及其与MHCⅡ类分子结合方式的不同，可将细菌毒素性超抗原作以下分类（表3-3)。

表3-3 细菌毒素超抗原的种类

分 类 依 据	种   类
产生菌 作用靶细胞 分子结构特点	葡萄球菌肠毒素（staphylococcus enterotoxin，SEs) 毒性休克综合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1) 链球菌致热外毒素（streptococcus pyrogenic exotoxin，SPEs) T细胞SAg B细胞SAg Zn2+协调亚家族（包括SEA、C、D、E、H、I和SPE) 非Zn2+依赖亚家族（包括SEB、G和TSST-1)

细菌毒素SAg是单肽链分子，大小约200～240aa（约22～30kDa)，多数SAg肽链中段有1个二硫键，形成一个环状结构。

Zn²⁺协调亚家族SAg的突出特点是，具有2个MHCⅡ类分子结合部位，一是N端暴露于肽链三维结构表面的疏水性“F-L”结构，对MHCⅡ类分子α链有低亲和力；二是肽链中部或C端，是一个保守Zn²⁺结合结构，内含3个Zn²⁺配体（一般是His和Asp)。这3个配体在三维结构中聚在一起，可与Zn²⁺结合，从而协调和稳定SAg与MHCⅡ类分子β链高亲和性结合。非Zn²⁺依赖亚家族SAg没有Zn²⁺结构，只有N端的F-L结构，对MHCⅡ类分子α链有低亲和性。

三、诱导免疫应答机制

（一)激活MHC表达细胞

超抗原不需要抗原提呈细胞（APC)的加工处理，但在大多数情况下，依赖于MHCⅡ类分子的提呈。不同的SAg激活MHC表达细胞（如单核-吞噬细胞、B细胞等)的机制是不相同的。

Zn^2＋协调亚家族SAg  Zn^2＋协调SAg以二种形式与MHCⅡ类分子结合：①单体分子：1个SAg单体分子只能与MHCⅡ类分子的其中一条肽链结合，形成二或三聚体，如SED-MHCβ和MHCβ-SED-MHCα等；②双体分子：在Zn^2＋协调下，Zn^2＋协调SAg可形成稳定的同型二聚体，继而促使MHCⅡ类分子双聚化，即同时结合2个MHCⅡ类分子形成四聚体，如MHCβ-SED-SED-MHCβ和MHCβ- SED-SED-MHCα。MHCⅡ类分子双聚化是诱导MHCⅡ类分子表达细胞活化的前提。因此，Zn^2＋协调SAg可直接激活单核细胞。

Zn^2＋协调SAg与所有MHCⅡ类分子表达细胞均可高亲和性结合，结合位点在MHCⅡ类分子β链抗原结合槽外侧的1个α螺旋上（图3-16)，故不受MHCⅡ类分子多态性的限制，即一种SAg可以和任何一种MHCⅡ类分子结合。

非Zn^2＋依赖亚家族SAg  由于没有Zn^2＋结合区，SAg不能形成同型二聚体。SAg肽链上只有N端1个低亲和性结合区，所以只能与1个MHCⅡ类分子α链结合，如SEB只能形成SEB-MHCα等二聚体分子。非Zn^2＋依赖SAg单体分子不能使MHCⅡ类分子双聚化，因而不能直接活化单核细胞。但通过刺激单核细胞膜CD40分子产生协同刺激信号，可弥补非Zn^2＋依赖SAg不能双聚化这一缺陷而激活单核细胞。

（二)激活T细胞

SAg与MHCⅡ类分子结合后，由APC提呈直接与TCR-Vβ连接，由于连接位点在抗原结合沟槽外侧（图3-16)，因而这一过程不受TCR∶MHC及CD4∶MHC反应的限制。SAg活化T细胞时，不像普通抗原同时受TCRVα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ多重限制，它们只与TCR-Vβ结合。由于人TCR-Vβ基因只有20余种，而一种SAg一般可选择地与几种TCR-Vβ分子相互作用，因此，SAg可激活大量的T细胞，即激活T细胞的百分比显著增加，大约占T细胞的10%～30%，比普通抗原高出数百倍以上。由于SAg具有强大的T细胞激活功能，可为抗肿瘤的靶向治疗和疫苗佐剂研制提供新的思路。

目前认为，SAg活化T细胞时，也需要CD80/ CD 86对T细胞上CD28的协同刺激，如果缺乏协同刺激作用，则T细胞的应答处于无能（angergy)状态，增殖水平很低，产生的细胞因子也极少。这也说明，大多数SAg之所以选择MHCⅡ类分子作为特异受体，可能是由于表达高水平MHCⅡ类分子的APC可同时表达高水平的协同刺激分子CD80/CD86。此外，亦有学者发现SAg可不依赖于MHCⅡ类分子，直接与TCR结合，诱导T细胞活化。

在体内，给予SAg可诱发广泛T细胞激活。T细胞先是数目增加，但数天后迅速减少，出现免疫抑制。T细胞减少是由于T细胞凋亡所致，可能是由Fas/FasL途径介导的。另外还发现，SAg可以通过TCRVβ(T)-SAg-MHCⅡ(B)的方式诱导B细胞活化。活化的B细胞可表达CD40和高水平的FasL，从而诱导表达Fas的T细胞发生凋亡。

SAg不仅可以激活T细胞，还可诱导其发生免疫耐受性，表现为再次接受SAg刺激时，相应TCRVβ特异性T细胞增殖水平和IL-2的合成量大幅度降低或减少。

可见，深入研究超抗原诱导T细胞活化、凋亡和免疫无反应性的机制，将有助于阐明淋巴细胞对自身抗原的免疫耐受机制和自身免疫病的发生机制，寻找阻止或逆转免疫耐受的方法，为超抗原用于抗肿瘤治疗提供理论依据。

（三)对B细胞的影响 

SAg对B细胞可产生显著影响，因为B细胞表达MHCⅡ类分子，可作为SAg提呈细胞。超抗原不能单独引起高度纯化B细胞的增生和分化成为抗体生成细胞，但在T细胞存在下，可诱导B细胞增殖，并促进其分化成为浆细胞，产生抗体。SEA和SED能低亲和性地结合于表达特定可变区重链（V_H)的B细胞膜型免疫球蛋白（mIg)，例如，SEA选择结合V_H3-B细胞，SED结合V_H4-B细胞。SEA和SED与V_H结合的特异性不受mIg的抗原结合沟槽、D区和J_H的限制，其结合位点在抗原结合沟槽外侧的FR1和FR3肽段。SAg与表达MHCⅡ类分子的细胞结合后，有可能先活化这些细胞，然后再诱导细胞凋亡。

此外，SAg结合在MHCⅡ类分子的抗原结合沟槽外侧，并不影响MHCⅡ类分子与普通抗原结合。但与MHCⅡ类分子结合的SAg，可能影响T细胞对APC提呈的普通抗原的应答。

四、生物学效应

超抗原作为一类强大的免疫激活因子，可活化T细胞和抗原提呈细胞，其作用范围从T细胞增殖的诱导，众多细胞因子释放，免疫抑制到免疫耐受和免疫无反应性。细菌毒素超抗原的生物学效应主要表现在2个方面：

对免疫系统的直接效应  SAg可以超常量激活T细胞和MHC表达细胞，由于T细胞被大量激活后，随之出现凋亡，T细胞数量减少，必然使宿主免疫功能下降，继发免疫抑制。此外，SAg还可能大量激活自身反应性T细胞或B细胞，有些B细胞可以持续地多克隆增殖分化，产生自身抗体，因而引起自身免疫病。如链球菌致热外毒素除能特异性增强链球菌溶素O对心脏的毒性作用外，还能刺激T细胞增殖，促进自身免疫病（风湿热)的发生。

由细胞因子介导的间接效应  SAg超常量激活T细胞和MHC表达细胞，使它们分泌过量的细胞因子，尤其是IL-1、IL-2、IL-6、TNF和IFN-γ等，导致免疫系统严重紊乱，往往对机体产生毒性效应，如体温升高，炎性细胞浸润，血管内皮细胞或其它细胞损伤，释放生物活性介质，渗透压平衡失调，增加机体对内毒素及其它毒素的敏感性等。因此，SAg与毒性休克综合征、类风湿关节炎、川崎综合征（kawaseki syndrome)、婴儿突然死亡综合征、食物中毒、猩红热、银屑病（牛皮癣)等都有密切关系。如INF与IFN-γ在葡萄球菌肠毒素B（SEB)引发的休克中发挥关键作用。

第五节 脂多糖

脂多糖（LPS)主要毒性成分脂质A与内毒素受体相互作用后，可诱导前炎症细胞因子系统而介导细胞毒反应，最终导致内毒素休克甚至多器官功能障碍综合征，病死率高达50%以上。因此，探讨LPS的分子致病机制，寻找有效的LPS干预途径具有重要意义。

一、分子结构特点

LPS由O-特异性多糖链（O-specificpolysaccharide chain)、核心多糖（core oligosaccharide)和脂质A或类脂A（lipid A)通过共价键依此连接而成（图3-16)，依靠脂质A锚在革兰阴性菌细胞外膜磷脂层上。

O-特异性多糖主糖链  由0～50个寡糖重复单位构成，每个重复单位含3～6个单糖分子。单糖种类有戊糖、氨基戊糖、己糖、氨基己糖、脱氧己糖等。O-特异性多糖变异性最大，如沙门菌A、B、D和E血清群的O-多糖链由“甘露糖-鼠李糖-半乳糖”三糖重复单位组成，C₂群的纽波特沙门菌则由“鼠李糖-甘露糖-甘露糖-半乳糖”四糖单位组成。沙门菌A、B、D和E血清群主糖链相同，但支糖链不同。因此，单糖的种类、数目、排列顺序和糖链的空间构象等构成了细菌的O抗原决定簇。

核心多糖  位于O-特异性多糖链与脂质A之间，由外核和内核组成。外核由3个己糖构成糖链骨架，此骨架因菌而异，例如，所有沙门菌的外核骨架是“Glc-Gal-Glc”（Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖)，但大肠埃希菌比较多样化，如大肠埃希菌K-12菌株是“Glc-Glc-Glc”，R4株是“Gal-Glc-Glc”，外核骨架上可连接不同的侧链，一般是己糖或氨基己糖。内核是高度保守的，绝大多数由3个L-甘油型庚糖（L-glyceroheptose，Hep)和1～3个2-酮-3-脱氧-D-甘露醇型辛酮糖酸（2-keto-3-deoxy-D-mannooctonate，KDO)构成。

脂质A  是LPS分子中最保守的部分，基本骨架由2个D-氨基葡萄糖（D-GlcN)以β-1,6糖苷键连接构成，通过非还原端D-GlcN6’位的α-糖苷键与KDO连接。脂质A的D-GlcN双糖上可连接多个基团，如图3-17所示，还原端D-GlcN（1)和非还原端D-GlcN（2)各有1个磷酸基团，其上可分别接R1和R2，如在大肠埃希菌R1是磷酸基团，R2是KDO。每个D-GlcN的C2-NH₂和C3-OH上可以各连接1个长链C3-OH-脂肪酸分子或1个(C3-O-脂肪酰)-脂肪酸分子。

图3-18  大肠埃希菌脂质A化学结构图

连接的脂肪酸分子因菌而异，且与脂质A毒性密切相关。一般连接6个脂肪酸分子的脂质A毒性最强，多于或少于6个，毒性则减弱。如大肠埃希菌脂质A的D-GlcN双糖上连有6个脂肪酸分子，沙门菌脂质A双糖连接7个脂肪酸分子，其LPS的活性比大肠埃希菌的要低。

二、LPS受体及入胞方式

病原微生物侵入人体后，先天免疫系统的各种细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、粘膜上皮细胞、抗原提呈细胞等依靠一组 “特式识别受体”(pattern recognition receptors，PRRs)，如CD14、Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)、ß2-整合素 (ß2-integrins, CD11/CD18)、巨噬细胞清道夫受体(macrophage scavengerreceptors)、补体受体CR1/CR2等识别“病原体相关分子特式结构” (pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。PAMPs包括革兰阴性菌的脂多糖（LPS)和脂蛋白，革兰阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸等。免疫细胞最重要的PRRs是CD14和TLRs。一旦PRR识别某一PAMPs后，这些效应细胞立即发挥作用。

LPS受体  LPS与宿主细胞的结合方式有两种：①非特异性结合：LPS的脂质A通过亲脂性的疏水作用与细胞膜磷脂结合，从而改变磷脂膜结构的物理和化学性质（如膜完整性、流动性、膜电势等)，产生相应信号转膜传导，影响细胞的状态和功能；②特异性结合：LPS通过脂质A与相应膜受体特异性结合。LPS的膜受体可能有多种，比较肯定的是CD14。

CD14（55kDa)有二种：一种是游离于血清中，称为可溶性CD14（sCD14)，另一种借助糖基磷脂酰肌醇（GPI)锚着于髓源性细胞（单核-巨噬细胞、中性粒细胞等)膜上，称为膜CD14（mCD14)。CD14一般不能直接与LPS结合，需借助LPS结合蛋白（LPSbinding protein，LBP)才能结合。

LBP（60kDa)是一种由肝细胞合成的急性期血清糖蛋白，对LPS脂质A有高度亲和性。LBP被认为是往返运输微生物产物至CD14 的载体，其N端与LPS结合，C端与s/mCD14结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，将LPS转递给CD14，其中sCD14可携带LPS粘附于不表达mCD14的细胞（如上皮细胞和内皮细胞等)。LPS的许多生物学效应是通过LBP/CD14介导的，LBP/CD14系统具有增敏内毒素的作用。因此，LBP抗体可保护机体免受LPS攻击。

入胞方式  LPS可能以两种方式进入细胞：①聚集的LPS或整个细菌与mCD14结合，然后内吞进入细胞，并被运送至溶酶体内，最终被溶酶体酶降解；②LBP催化LPS单体分子与s/mCD14结合，然后以LPS-LBP-mCD14复合物的形式内在化进入细胞，最终聚集在高尔基体内。

在LPS与mCD14结合及内在化过程中可发生激活TLR4信号转导，但由于mCD14只是借助GPI锚着于细胞膜上，没有跨膜区，因此没有能力启动一个跨膜的活化信号，须依赖其它跨膜蛋白分子传导LPS信号。

三、LPS信号转导途径—IκB/NF-κB系统

Toll样受体  1988年，Hashimoto等发现在果蝇细胞膜上有一种属于Ⅰ类跨膜蛋白的受体，称为Toll受体，最初被确定与果蝇胚胎发育及防御作用有关。后来发现从昆虫到人都有氨基酸序列同源性极高的Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs)家族，该家族成员属于先天免疫系统，参与非特异性免疫防御的各种细胞精确识别病原体相关分子。TLRs由胞外结构域（domain)、跨膜结构域和胞内结构域组成，其胞内结构域与Ⅰ型IL-1R的胞浆信号区有显著的同源性，因而被认为属于IL-1R超家族。目前已确定了10种人类TLR的全长基因，其中研究较多的是TLR4和TLR2。

TLRs主要表达在单核-巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、肠上皮细胞以及内皮细胞膜上，这些都是在感染早期直接接触微生物的细胞。TLRs胞外结构域有多个富含亮氨酸重复序列拷贝，可以识别和结合病原微生物或其产物，激活胞内信号转导系统，如可接受CD14转导的信号；胞内结构域含有Toll/IL-1R(TIR)模块，与细胞内调节蛋白MyD88和IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)的复合物相连接。目前认为，TLRs可能可以启动多条信号传导途径，但其中最重要的是核转录因子-κB（nuclearfactor，NF-κB)途径。

NF-κB  在细胞内，存在着一个调控基因转录的IκB/NF-κB系统。最初，NF -κB作为一种结合于基因增强子的转录因子被认识，但现在证实它们对许多基因，包括免疫防御、炎症和凋亡过程的基因表达起着中心调控作用。已发现5种NF-κB蛋白，在所有NF-κB蛋白N末端都有1个高度保守的Rel同源区(RHD),NF-κB分子通常依靠RHD连接形成二聚体分子，其RHD区结合有DNA和抑制蛋白IκBs。IκBs也是多基因家族，在哺乳动物已发现7种IκBs蛋白。IκB家族蛋白肽链上有多个锚蛋白重复拷贝，这些锚蛋白是蛋白连接模块，可与NF-κB的RHD连接。

在静息细胞内，NF-κB双聚体与IκBs结合，以非活化形式停留在细胞浆内。当细胞受到病原微生物感染、脂多糖、细胞因子等刺激后，NF-κB可被激活，启动基因的转录（参见第4章)。

LPS激活TLR4的信号途径 Toll样受体是LPS跨膜信号转导的辅助受体。现已证实，TLR4和TLR2的信号转导途径存在微妙的差异，TLR4由于结合了MD-2 分子，具有LPS应答能力，可能是G^－菌的信号转导受体，而TLR2主要作为G^＋菌和酵母菌的识别和激活受体。

在 MyD88依赖性信号转导途径中，革兰阴性菌释放的LPS在血流中与LBP结合形成复合物，然后与单核细胞和巨噬细胞表面的mCD14结合，LPS、LBP和CD14三者相互作用，导致TLR4同型二聚体的胞内TIR区发生构象改变，从而能募集并激活转接蛋白MyD88。之后，由MyD88与IL-1受体相关激酶（IRAK)的N端死亡结构域连接而导致IRAK自动磷酸化，激活的IRAK从受体复合物解离，继而激活TNF受体相关因子6（TNFreceptor-associated factor 6，TRAF6)，由后者再激活丝裂原活化蛋白3激酶（mitogen-activatedprotein 3 kinase，MAP3K)家族成员TAK-1。该激酶激活后，进一步活化IκB激酶(IκB kinases，IKKs)复合物。活化的IKKs将IκB磷酸化，随后磷酸化的IκB被一种26S的蛋白酶降解，NF-κB被解除抑制，游离释放，并移位进入细胞核内，与κB基序（κBmotif)结合，启动基因转录，发挥调控作用，诱发一系列免疫炎症反应（图4-19)。

TLRs及其胞内信号传递分子的发现，将有助于阐明LPS介导的信号转导机制，为治疗内毒素休克这一致死性的临床综合征提供新的思路。

四、LPS生物学效应

NF-κB调控的靶基因大致有以下几种：

参与炎症和早期防御的基因  所编码的主要产物有：①细胞因子，如TNF-α、GM-CSF、IL-1/-2/-6/-12；②细胞粘附分子，如细胞间粘附分子（ICAM)、血管细胞粘附分子（VCAM)、E选择素（ELAM)；③急性期蛋白；④诱导酶，如诱导型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase，INOS)；⑤抗菌多肽，如ß-防御素（β-defensins)。这些产物直接参与炎症反应和非特异性抗菌反应，也诱导协同刺激分子CD80的表达。

参与特异性免疫的基因  主要包括MHC、IL-2/12、IFN-γ、协同刺激分子CD80（B7-1)和CD86（B7-2)的编码基因。这些基因产物可协同激活特异性免疫细胞，并参与调控特异性免疫应答。如CD80/CD86与CD28结合为T细胞TCR-CD3活化途径提供重要的协同刺激信号（co-stimulatingsignal)。

编码影响细胞凋亡的关键性蛋白的基因  如c-IAP-1/-2、Fas配体、c-myc、p53等的编码基因，这些产物可启动细胞凋亡过程（参见第4章)。

可见，LPS一般不直接损伤各种组织器官的细胞，而是通过刺激参与先天免疫防御的各种免疫细胞和内皮/粘膜细胞，诱导产生各种细胞因子、炎症因子、急性期蛋白、活性氧/氮分子、抗菌多肽，以及激活特异性免疫细胞，引起各种组织器官以及全身性多种病理生理反应。主要临床症状有发热、白细胞数目改变、Shwartzman反应、DIC、内毒素血症、休克等。

第六节  细菌毒素在医学上的应用

细菌毒素可用于制备疫苗或抗毒素等生物制品，以预防或治疗相应毒素中毒症以外，在医学上还有多种用途。细菌毒素可作为一个有效、特异的手段，应用于细胞生物学（毒素内在化的路径及其与细胞器的相互作用、越膜信号、G蛋白)、神经生物学（神经介质的释放、与突触囊泡的相互作用)、免疫学（单克隆抗体、细胞因子)、药学（炎症因子的释放)。有目的地选择细胞特异受体或胞膜分子，可设计新的以天然、合成或重组毒素为基础的免疫原作为疫苗和有效药物或潜在的抗肿瘤或抗病毒疗法。

一、药物

厌氧芽孢梭菌属细菌能产生很多毒素，统称为梭菌毒素，其中许多可能用作临床药物。在一些国家，BoNT-A已经准许有限制地用于临床治疗，主要治疗许多痉挛性病症和痛症，如不随意肌（胃、肠、血管、心肌等)痉挛、张力障碍、局部肌肉痉挛、肌筋膜痛等，特别是治疗麻痹性斜视、紧张性头痛和偏头痛较为成功。

体外试验表明，TcdA、产气荚膜梭菌肠毒素等可损伤多种体外培养的肿瘤细胞系。在动物实验中，TcdA还表现出优先选择癌变细胞，可以诱导癌细胞凋亡。已有人提出用TcdA治疗结肠癌和胰腺癌。

已证实TcdA和BoNT-C2粘附于肥大细胞后可诱导其脱颗粒，TcdA还可引起微循环障碍，因此TcdA和BoNT/C2可用于调控变态反应和治疗炎症。

LPS也有抗肿瘤作用。19世纪美国人Coley曾用灭活的化脓性链球菌和灵杆菌滤液制成“Coley毒素”用于治疗肿瘤病人，取得较为肯定的疗效，Coley毒素的本质就是LPS。据报道，在临床上用绿脓杆菌菌苗治疗肿瘤患者，5年存活率高于化疗患者。LPS的抗肿瘤机制尚未完全阐明，但其引起的微循环障碍和血管内皮损伤，可以导致肿瘤先缺血后出血性坏死。此外，LPS还可诱导产生TNF、IFNs、ILs等多种细胞因子，可活化巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞等，均可参与抗肿瘤作用。

二、免疫调节

LPS可以活化单核-巨噬细胞等，分泌多种细胞因子，增强宿主的非特异性免疫功能。但由于LPS的毒性多样且复杂，用于临床难以控制，目前有不少研究者正在使用物理、化学和生物学方法，制取或寻找无毒或减毒的变异LPS及其衍生物，用于动物抗肿瘤实验。

SAg具有抗肿瘤效应。一方面，SAg可大量激活CD8^＋Tc细胞；另一方面，SAg可与MHCⅡ类分子结合，刺激CD4^＋T细胞产生大量细胞因子如TNF-γ、IFNs、ILs等，这些细胞因子可进一步活化巨噬细胞、NK细胞等，从而发挥自然杀伤作用，显示抗肿瘤效应。此外，TNF-γ、IFNs等细胞因子又可促进肿瘤细胞对MHCⅡ类分子的表达，增强抑瘤效果。因此，SAg有可能成为一类抗肿瘤新药。已有一些SAg的体外或实验动物抗肿瘤实验的报告，如SE-A或SE-B可杀伤体外培养的表达MHCⅡ类分子的结肠癌细胞，对不表达MHCⅡ类分子的肿瘤细胞也可产生间接的旁观者效应。

三、免疫毒素

概念  免疫毒素（immunotoxins，ITs)是人工制备的导向疗法生物制品，由选择特定靶细胞的定位部分（导向载体)及杀伤靶细胞的治疗部分（弹头)构建而成。

ITs的定位部分也称为导向成份（targetingmoiety)，它的作用是代替毒素的结合区，因此必须对靶细胞有高度特异性和高亲和力。导向成份一般选择较小分子量的生物成份，如针对靶细胞膜表面抗原的McAb或它的可变区片段（fragmentvariable，Fv)，或是膜受体的相应配体，如细胞因子、生长因子、激素和CD抗原分子等。如制备治疗T细胞白血病和淋巴瘤的ITs，导向成份可选用IL-2或IL-4；治疗上皮癌的ITs可选用表皮生长因子（表3-4)。

ITs的治疗部分一般选用生物毒素或化学制剂。常用的生物毒素有植物毒素、真菌毒素和细菌毒素。细菌毒素由于分子小且结构较简单，生物活性高，比较容易与导向成份连接，以及容易大量获取，所以较适宜制备ITs。目前用得最多的是DT、PEA和溶细胞毒素等（表3-4)。此外还可用杂合毒素（如蓖麻毒素-PEA)或双弹头毒素（一个载体连接两种毒素)。

表3-4 部分免疫毒素和相关疾病

靶细胞受体	免疫毒素	临床适应症
IL-2R IL-4R IL-6R IL-9R EGF-R FGF-R GM-CSF-R 转铁蛋白 HIV gp120	IL-2-PE40、IL-2-DT IL-4-PE40 IL-6-PE40 IL-9-ETA PE40-TGFα FGF-PE DT-GM-CSF 抗-转铁蛋白-DT gp120单抗（Fab)-PE基因	淋巴瘤、自身免疫病、AIDS 淋巴瘤、胶质瘤 koposi瘤 霍奇金病、淋巴瘤 多种肿瘤 肢体先兆局部缺血 淋巴瘤、白血病 脑肿瘤 AIDS

化学交联免疫毒素  利用活泼的化学交联剂，修饰完整毒素和抗体（多为鼠源性)纯化蛋白分子肽链上的某种化学基团，将两者以共价键连接而成。这种免疫毒素分子量大、免疫原性大、组成不均一、穿透力弱，因此，在临床应用上受到限制。

重组免疫毒素（recombinant　immunotoxin)  利用克隆技术获取细菌毒素（如DT-A或PEA-Ⅲ区编码ADPR转移酶肽段)的编码基因，通过DNA连接酶与导向因子（如抗体、生长因子等)的基因片段连接，构建成重组免疫毒素基因，克隆至高表达质粒中，然后导入大肠埃希菌等原核细胞中表达。细菌大量培养后，收集菌体并破碎之，提纯获得免疫毒素。为增加重组免疫毒素的穿透力和降低抗体的免疫原性，可采用基因重组技术，构建单链抗体、二硫键抗体等小抗体分子和人源化抗体。但是，重组免疫毒素仍存在非特异性杀伤作用、调节手段少等缺点，对实体瘤的穿透力仍然很弱。

基因免疫毒素（genetic immunotoxin)  弹头部分不是毒素，而是携带毒素编码基因的重组质粒（图3-20)。质粒在某个细胞系相关的真核启动子/增强子控制下，由导向载体引入靶细胞中，经诱导后即可表达毒素。导向部分是人源单链抗体和碱性的鱼精蛋白的基因融合表达产物。鱼精蛋白带有很强的正电荷，能与质粒DNA牢固结合。基因免疫毒素具有高特异性、更低的免疫原性、更强的细胞毒性、更长的药物持久性和可控性，在恶性肿瘤的治疗上将具有很大潜力。

图3-20  常规免疫毒素与基因免疫毒素的结构示意图

目前已有一些ITs在临床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期试验中取得一定效果，主要用于治疗癌症、自身免疫病、移植物抗宿主反应（graft-versus-hostdisease，GVHD)和AIDS等。

四、医学研究

许多梭菌毒素已经用作医学研究的材料或工具。如在实验动物的大脑海马部注入TeNT，已建立了慢性癫痫综合症的动物模型。通过研究这一动物模型的行为变化、局部或全身性癫痫发作、模拟人类与肢体癫痫有关的学习无能及临床心理变化，可以更深入地研究癫痫病的临床表现及对机体生理的影响，寻找治疗癫痫的方法和药物等。通过研究这种动物模型，研究者已经提出一种值得注意的假说：梭菌如破伤风梭菌或肉毒梭菌在肠道内寄生或感染，或许不会引起明显的由TeNT或BoNTs引起的痉挛或麻痹，但可能通过肠道微量吸收这些毒素而使某些人处于一种慢性疾病状态，如孤独症。

在实验动物体内证实，TeNT比任何一种蛋白都更快速地从循环系统进入中枢神经系统。TeNT的含有R区的Hc肽段对机体是无毒的，将治疗中枢神经系统疾病的药物或蛋白分子与Hc肽段连接，利用Hc肽段将药物分子快速送进中枢神经，可以解决药物难以进入中枢神经系统困难，对治疗中枢神经系统疾病有着重要意义。

动物实验表明，LT与CT具有粘膜免疫佐剂作用。有相当多的抗原单独口服不会诱导粘膜局部免疫应答或容易引起免疫耐受，但如果与LT或CT同时口服，则可产生粘膜免疫应答。而用LT-B或CT-B作为佐剂，免疫诱导作用不明显，须在B亚单位佐剂中加入微量全毒素才能表现较好的佐剂作用，这表明LT或CT的佐剂作用可能要依赖于A亚单位的ADPR转移酶活性，但LT或CT的毒性限制了它们的应用。如何将LT或CT改造为无毒的免疫佐剂已成为研究热点。

（刘琥琥  广东药学院)