第13章  微生物疫苗

自我国首创用人痘预防天花后，18世纪末Jenner通过研究挤奶女工得牛痘后不再患天花这一现象，发现接种牛痘病毒可以预防天花，从而开创了疫苗（vaccine)接种的历史。此后微生物疫苗迅速发展，炭疽、狂犬病减毒活疫苗和鼠疫、伤寒灭活疫苗等相继问世。迄今，疫苗的发展历经三个主要阶段：①古典疫苗时期：主要建立在对感染性疾病反复观察和摸索的基础上，以牛痘苗和狂犬病疫苗为代表；②培养疫苗时期：采用组织或细胞培养技术可获得许多减毒或灭活的疫苗，以脊髓灰质炎疫苗、卡介苗等为代表；③基因工程疫苗时期：基因工程技术为疫苗的研制注入了全新的设计思路，最成功的例子是乙型肝炎基因工程疫苗。

现代疫苗学的发展策略主要是：①将病原微生物候选抗原基因克隆到合适的载体，再道入适宜的表达系统中表达目的抗原遗传信息；②选择缺失基因的减毒病原体载体，插入一些外源基因，当这些活载体疫苗进行流产性复制时，表达出的抗原暴露于宿主免疫系统；③预防多种疾病、接种次数少的多价抗原联合疫苗；④利用质粒DNA诱导免疫应答的核酸疫苗；⑤疫苗的免疫增强物及对免疫系统的调节；⑥特定免疫原或免疫调节提呈的新型微载体系统。

疫苗的形式从过去较单一的灭活疫苗、减毒活疫苗，发展到现代的基因工程重组蛋白质疫苗、化学合成多肽疫苗（包括表位疫苗)及核酸疫苗；疫苗的功能从预防发展到预防与治疗；疫苗的范围从微生物疫苗外延为肿瘤疫苗、抗心血管病疫苗、避孕疫苗等。

第一节 灭活疫苗

早期使用的主要是灭活疫苗（inactivated vaccine)，它是指用化学或物理的方法，将具有感染性的完整的病原体杀死，使其失去传染性而保留抗原性，接种后可刺激宿主产生针对其抗原的免疫应答，从而达到预防该病原体感染的目的的一类疫苗。

在制备灭活疫苗中，使用较多的灭活剂是甲醛，它具有灭活病原体活力与保留抗原性的双重作用。对于病毒来说，理想的灭活剂应能特异地作用于核酸而不影响衣壳或包膜蛋白，甲醛因能使蛋白质变性，并不是一种理想的灭活剂。挥发性的β-丙内酯仅作用于核酸使病毒灭活，已用于乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗等生产。

目前广泛使用的灭活疫苗，国内有伤寒疫苗、乙型脑炎疫苗、百日咳疫苗、钩体病疫苗等，国外有鼠疫疫苗、流感疫苗、脊髓灰质炎salk疫苗等。狂犬病灭活疫苗只在紧急情况下，给被疯兽咬伤者使用。

灭活疫苗制造工艺相对简单，免疫原性稳定性高，易于制备多价疫苗，疫苗安全性高，储存及运输方便，但也存在以下明显不足之处：

（1)需要严格灭活  就强毒株而言，如果不进行非常严格的灭活，则难以保证疫苗中不含有灭活不彻底的病原体。

（2)过敏反应  免疫力不够持久，需多次接种，剂量较大，有可能导致机体对接种的异种蛋白产生不良的过敏反应。

（3)感染加重现象  某些灭活疫苗，如早期使用的麻疹疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗，虽然可诱导产生一定的抗体，但一旦宿主被病原体感染后，产生临床表现的严重程度往往会超过未经免疫者。

（4)免疫不全面  灭活疫苗不能模拟病原体在宿主中的自然感染过程，如无吸附、复制、释放等，难以通过内源性抗原加工提呈，抗原种类不够全面，所接触到的免疫细胞有限，因此，它主要刺激宿主产生体液免疫，不能产生全面的免疫应答，特别是细胞免疫应答。对于那些主要靠细胞免疫预防感染的病原体来说，免疫效果往往低下，甚至无效。

第二 减毒活疫苗

减毒活疫苗(live-attenuated vaccine)是指通过人工的方法，将病原体的毒力降低到足以产生模拟自然发生隐性感染，诱发理想的免疫应答而又不产生临床症状的一类疫苗。

减毒方法多为人工体外培养，最为经典的减毒活疫苗为卡介苗（BacillusCalmeete Guerin， BCG)。1907～1920年，Calmette和Guerin将一株有毒的牛型结核杆菌接种在含有胆汁、甘油的马铃薯培养基中，连续传代培养230代，历时13年，获得一株毒力减弱但仍保持高免疫原性的变异菌株，它可使接种动物产生对结核的免疫力。该菌株后来被命名为卡介苗，已在全球推广应用于结核病的预防接种。

目前，减毒活疫苗仍是预防接种中使用较多的一类疫苗，主要包括BCG、口服脊髓灰质炎活疫苗（OPV)、麻疹疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、甲型肝炎疫苗等。

与灭活疫苗相比，减毒活疫苗的最大优点是：能诱发全面、稳定、持久的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答；一般只须接种1次即可达到预防目的；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫，避免一些因注射免疫而引起的局部反应或合并征。但由于使用了减毒的活的病原体，在制备和使用过程中存在一些安全性隐患问题，主要包括：

1．回复突变危险 减毒活疫苗虽然毒力已降低到不足以引发临床症状，但作为一种活的病原体，仍有毒力返祖的可能，并可能对被免疫者产生严重后果。

2．使用范围相对狭窄  对于免疫功能低下或缺陷者，减毒活疫苗可能仍有一定的致病性，甚至诱发严重疾病，因此，一般也不提倡给孕妇使用。

3．外源性病原体污染  减毒活疫苗在体外传代减毒过程中，培养基、细胞株或操作过程均有被外界病原体污染的可能性。

4．有效期短和热稳定性差  由于这类疫苗是活的病原体，因此，使用的有效期一般较短，在保存及运输上往往需要在低温条件下进行，如保存不当可造成效价下降，甚至失效。

近年来，利用分子生物学技术，去除与毒力有关基因片段，使病原体毒力减低或丧失。因缺失突变毒株制成的疫苗称为基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine)。与自然突变株（多为点突变毒株)相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。

第三节  亚单位疫苗

对于某些抗原性弱且易于发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。一些免疫保护机制不清，可能诱导免疫病理反应，有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以用传统方法生产疫苗。

为消除减毒活疫苗的回复突变和灭活全疫苗的感染性复活作用，提高疫苗的纯度，最理想的是制备不含病原体核酸，仅含能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或表面抗原的疫苗，即亚单位疫苗(subunit vaccine)，其突出优点是：已除去了病原体中不能激发机体保护性免疫和对宿主有害的部分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明显增强而稳定，可靠性不断提高，对机体引起的不良反应越来越小。

一、基因工程蛋白质疫苗

基因工程疫苗(genetic engineering vaccine)是利用基因工程重组技术和蛋白质工程技术，将病原体中能诱导保护性免疫应答的抗原决定簇的编码基因，导入细菌、酵母菌、昆虫杆状病毒或哺乳动物细胞等高效表达，再通过提取、纯化目的蛋白而制成。不同表达系统的差别主要是蛋白质翻译后加工的不同，如通常在哺乳动物细胞内表达的蛋白质最接近天然抗原，而在细菌内不能进行蛋白质的糖基化，酵母菌中则可能过度糖基化。

基因工程疫苗可以通过MHCⅡ类分子限制性激活CD4细胞而使宿主产生针对目的蛋白的中和抗体，其研制成功的关键在于选择强免疫原性的病原体蛋白亚单位。这些亚基往往是病原体表面的亲水亚基（表面结构蛋白)，如乙型肝炎病毒HBsAg、巨细胞病毒糖蛋白gpB、EB病毒包膜糖蛋白gp350、流感病毒血凝素（HA)和（神经氨酸酶（NA)、艾滋病病毒包膜糖蛋白gp120和gp41等。另外，所表达的目的蛋白的空间构象及氨基酸序列是否与病原体的天然蛋白一致，也与基因工程疫苗的保护性显著相关。因此，对不同的病原体亚单位需用不同类型的蛋白表达系统。

目前，基因工程疫苗发展的重点为：①不能或难以培养的病原体，如乙型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒、麻风杆菌等；②有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体，如人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、登革病毒、呼吸道合胞病毒等；③传统疫苗效果差或不良反应大的病原体，如霍乱、百日咳等；④能简化免疫程序、降低成本的多价疫苗，如以痘苗病毒、腺病毒、卡介苗或沙门菌属为载体的多价活疫苗等。

基因工程疫苗只是病原体部分基因片段的产物，可避免使用完整病原体而可能带来的致病性。但是，某些病原体的基因工程疫苗的抗原性不够强，诱发特异性细胞免疫应答水平较低，需重复接种，故仍需进一步改进和完善。

二、表位疫苗

表位（epitope)或抗原决定簇（antigenic determinant)是病原体中组成相对小，但具有免疫原性的短肽序列，它可诱发病原体特异性的保护性免疫应答。

T细胞表位疫苗  T细胞表位是抗原经过抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC)加工后，由MHC分子提呈给T细胞抗原受体(Tcell receptor，TCR)的短肽。抗原常根据来源分为两大类：细胞内合成的抗原称为内源性抗原（endogenous antigen)，如受病毒感染细胞合成的病毒蛋白或肿瘤细胞内合成的蛋白；来源于细胞外的抗原称为外源性抗原（exogenousantigen)，如被吞噬的细胞或细菌。

内源性抗原  内源性抗原多以靶细胞作为APC。在细胞内核糖体上合成后，转运到巨大多功能蛋白酶体(proteosome)降解成短肽后，经抗原提呈相关转运分子（transporterassociated with antigen processing，TAP)转运至内质网腔，并进行一定的修剪，最终形成T细胞表位，进入MHCⅠ类分子的沟槽，经高尔基体运送到细胞膜上，再与CD8^＋CTL细胞上TCR结合，诱发细胞免疫应答（图13-1)。

外源性抗原  抗原首先被APC捕获，进入内体（endosome)中，再转运至溶酶体中，被裂解成一系列短肽片段后，在内质网内与MHCⅡ类分子结合，然后将抗原肽-MHCⅡ类分子复合体运送到APC细胞膜表面，提呈给CD4^＋Th细胞，激活Th细胞以辅助B细胞产生特异性抗体。活化的Th细胞还可释放一些细胞因子，介导NK细胞等免疫细胞产生细胞免疫应答（图13-1)。

因此，根据抗原处理和提呈过程的差异，T细胞表位疫苗可分为两类：一类是与MHCⅡ类分子结合的CD4^＋T细胞表位疫苗，另一类是与MHCⅠ类分子结合的CD8^＋T细胞表位疫苗。

发展T细胞表位疫苗的关键在于鉴别可为T细胞与MHC分子共同识别的特异性肽段。同一种MHC分子可识别一组具有某些共同结构特点的T细胞表位，例如，人类白细胞抗原（HLA)-A2.1限制性T细胞表位的第2位多为Leu，而第9位总是疏水性氨基酸；HLA-B27限制性T细胞表位的第2位多为Arg，其羧基端多为亲水性氨基酸。这些简单的共同结构称为肽模块或基序(motif)，其氨基酸残基是与MHC分子沟槽紧密结合的锚定残基(anchorresidue)。如何从复杂的蛋白分子中寻找特定的肽分子，诱生高效的免疫应答及保护性，有赖于对APC、MHC分子及微生物基因组学的深入认识。

研制T细胞表位疫苗的方法包括：①根据MHC分子结合T细胞表位的特点，可对序列已知的抗原进行T细胞表位的预测，有目的地设计和合成含有T细胞表位的短肽；②将编码特异性抗原的微生物基因克隆到合适的表达载体，在体外进行高效表达，以获得抗原肽疫苗，或将重组表达载体直接导入宿主细胞进行表达。

B细胞表位疫苗  由于B细胞抗原表位可与细胞膜表面直接结合，而T细胞抗原表位需经过抗原加工与提呈，因此，B细胞表位疫苗的免疫效果要优于T细胞表位疫苗。

多表位疫苗  是指针对同一病原体的多个抗原靶标或多种不同病原体的多种抗原的一种新型疫苗，可对病原体生活史的不同阶段或多种不同的病原体提供保护作用。精心组合的多表位疫苗可以被多种遗传背景的MHC分子识别并结合，从而得到高效提呈。

目前，表位疫苗的研制还处于实验阶段。研究较为成熟的表位疫苗包括HBV的PreS区第21～41aa和133～145aa、口蹄疫病毒VP1的第141～160aa片段，已分别在猩猩和猪中证实具有保护作用。

表位疫苗构成形式单一，稳定，不良反应少，使用较安全，但也存在以下不足：①合成肽是一种直链结构，缺乏天然蛋白的三维构型，功能与天然蛋白不同；②半衰期短，一般只有几分钟，在免疫过程中易被宿主体内蛋白酶分解；③分子量小，免疫原性较差。以上问题可通过目标氨基酸置换及添加佐剂的办法得以部分解决。

图13-1 抗原提呈细胞对外源性与内源性抗原的递呈作用

第四节  核酸疫苗

1990年Wolff等首次意外发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达。进一步研究证实，外源基因直接注入宿主后不仅可表达蛋白，还可诱生特异性免疫应答。从此，核酸免疫(nucleic acid immunization)成为世界瞩目的防治感染性疾病的研究热点。

核酸疫苗（nucleotide vaccines)，又称DNA疫苗，是由载体（如质粒DNA)和编码病原体某种有效抗原的cDNA组成，更确切的说，是将编码某种或多种特定蛋白的基因克隆到一个真核质粒表达载体上，然后直接注射到体内，以期在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。由于核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。

一、免疫机制

核酸疫苗刺激宿主免疫应答的机制仍不十分清楚。局部注射的核酸被周围的细胞（包括局部的组织细胞、抗原提呈细胞或其它炎症细胞等)摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。这些蛋白质被蛋白酶复合体降解成含有抗原表位的短肽，其中一部分作为“内源性抗原”，与MHCⅠ类分子结合，Ⅱ诱发较强的CTL细胞免疫应答；另一部分短肽作为“外源性抗原”，与MHCⅡ类分子结合，诱发偏向Th1型免疫应答。合成的目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体（图13-1)。

DNA疫苗接种后，机体内仅表达pg～ng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答，如何解释这一现象呢？近年发现，如果目的基因（包括载体质粒)含有CpG基序（motif)的回文序列，尤其是含NTCGNA或NACGTN的核心回文序列，则不但能激活较强的CTL效应，还能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激DNA序列（immunostimulatory DNA sequence，ISS)。究其原因可能是CpG基序与IL-2、TNF-β、IFN-γ的基因结构相似而产生协同作用。

二、构建与免疫

核酸疫苗大多是以质粒DNA为免疫原注射体内，具有更加稳定、易构建、操作更方便及目的基因表达时间更长等特点。核酸免疫一般包括以下几个过程：

1.目的基因的选择  核酸免疫的目的主要是诱发宿主产生针对目的蛋白的特异性体液和/或细胞免疫应答。目的基因的选择侧重于免疫原性，即它所表达的蛋白刺激机体免疫应答的能力。

宿主对外来抗原能否产生有效免疫应答是由多方面因素决定的，其中最为关键的是，这些抗原分子能否被APC处理并提呈抗原，能否被MHC分子识别并形成抗原肽-MHC复合物，激活CD8^＋或CD4^＋T淋巴细胞，以诱生特异性的抗体或细胞毒性T细胞。因此，核酸疫苗所表达的目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。

此外，核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或癌基因核酸免疫。同时还要注意一些目的蛋白本身的不良反应，以及多重核酸免疫（2个或2个以上的基因同时免疫)中不同基因之间的相互影响。为此，美国FDA明确规定，凡是用于核酸免疫的核酸，必须对其所有的结构功能，以及多重核酸免疫各基因之间的相互作用十分清楚。

2．载体的选择 狭义的核酸免疫并非直接注射携带目的基因的质粒DNA，而是直接注射目的基因。但这种目的基因往往只是含有表达某种蛋白所必须的外显子、内含子和必要的调节基因，如启动子、增强子以及5＇端加帽，3＇端加poly A尾等的修饰基因，它本身并不能自我复制。由于目的基因来源不同，在真核细胞中的表达效果也不同，因此有必要将目的基因克隆到一个载体上，使其能较长期地表达目的蛋白。用于制备DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。

用于核酸免疫目的的重组质粒可分为两个部分：①转录部分：由启动子、插入的抗原cDNA和poly A终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答；②佐剂部分：CpG基序直接刺激B细胞和单核细胞，诱导Th1型细胞因子和APC膜上协同刺激分子的表达，产生针对目的蛋白的免疫应答。人为地增加CpGDNA的用量可提高DNA疫苗的效率。

尝试使用更有效的表达载体可提高DNA疫苗的免疫效果，如将HSV-1 gpB基因克隆于甲病毒毒株Sindbis表达载体 pSIN15和pS1N25中，单次、低剂量的重组载体免疫小鼠后，可诱发全面的免疫反应及保护作用，原因可能是，极少量的pSIN载体进入细胞后，复制出大量的RNA模板，并表达出高水平的外源基因产物，模拟自然病毒感染的特性，诱导产生干扰素。pSIN载体中含有常规DNA载体中不存在的病毒非结构蛋白，能起到免疫促进子的作用。

3．启动子的选择 质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。不同的启动子在不同机体组织中表达的水平可以显著不同，而表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。研究发现，巨细胞病毒（CMV)和呼吸道合胞病毒（RSV)的早期启动子分别是肌肉和上皮细胞内理想的启动子，其它常用的启动子还有猿猴病毒SV40、HIV长片段重复末端启动子(LTR)、EB病毒等基因上的启动序列，这些启动子作用虽然较弱，但可控制外源蛋白持续低水平表达，有利于免疫应答的长期维持。常用的poly A加尾信号为SV40及LTR。为了增加质粒在哺乳动物细胞中的拷贝数，还常用一些不与宿主细胞基因整合的基因如EBNA1（EBV核抗原编码基因)等，以增加目的基因的表达量。

4．DNA疫苗的优化  为了使所表达的目的蛋白能发挥最大的免疫作用，一般可采用以下二种方式构建：

（1)联合构建：在一个质粒中同时将2个或2个以上目的基因构建在一起，包括既能刺激CD8^＋T细胞产生特异性CTL的抗原表位，又能刺激CD4^＋T细胞产生体液免疫的抗原表位，因而可诱导机体产生强大的免疫应答。

（2)协同构建：将目的基因与某种细胞因子的基因构建在一起，以促进目的基因的免疫效果。例如，IL-4能有效作用于B淋巴细胞，是Th2型细胞分化的最强刺激物；IL-2、IL-12、IFN-γ等能增强Th1型细胞免疫；CD80（B7-1)作为一种协同刺激因子，对CD8^＋CTL与CD4^＋Th淋巴细胞活化均起作用，可同时加强细胞免疫和体液免疫应答。

此外，可将DNA疫苗与蛋白质疫苗联用，可获得更好的免疫效果。

5．免疫途径、剂量、时间  这是最主要的影响因素，关系到核酸疫苗刺激宿主能否获得最佳的免疫应答效果。最常见的免疫途径有：肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。肌肉细胞抗原提呈能力弱，但摄取外源DNA能力强，生活周期长，新陈代谢较缓慢，注射的核酸可长期存在，是目前主要的免疫靶细胞。皮肤细胞的抗原提呈能力很高，但转染效率较低，可采用基因枪皮内接种以增强转染率，诱导小鼠产生抗原特异性Th1型细胞反应，表现为IgG2a、IFN-γ升高。粘膜免疫除产生局部免疫球蛋白SIgA，在病原体入侵部位发挥特异性监视作用外，还可诱发全身免疫应答，对于一些经粘膜医学招聘网入侵的病原体来说，这是一种有效的免疫方法。

肌肉注射能诱导有效免疫应答的DNA用量一般为16ng～400ug，免疫时间为10d～1个月。基因枪颗粒轰击法对外源基因摄取的效率是最高的，低至16ng的核酸即可诱发有效的免疫应答。DNA疫苗免疫应答水平与剂量直接相关，而剂量与宿主细胞对外源性核酸摄取能力有关。

肌肉注射、皮内或皮下接种都存在DNA摄取效率低或需要特殊设备缺点。另外，裸DNA在细胞质中停留至开始转录，约50%～100%被降解。可见，如何将DNA疫苗载体高效导入抗原提呈细胞（APC)显得十分重要。

胞内菌感染宿主细胞后，可被APC吞噬杀灭，其携带的质粒DNA释放出来，进入细胞核，使目的抗原基因得以表达。因此，可将重组减毒、代谢能力缺陷型胞内菌（如沙门菌、志贺菌)作为DNA疫苗载体，通过粘膜自然感染途径运送DNA，其优势主要体现在：①减毒胞内菌可提高质粒的转染效率，同时靶向巨噬细胞和树突状细胞；②载体菌的某些组分可作为佐剂，增强DNA疫苗免疫效果；③易于生产，可以口服方式接种，同时激活粘膜免疫和全身免疫；④易于构建多价疫苗。

三、安全性

由于有外源性基因的导入，核酸疫苗的安全性一直受到关注。虽然动物模型研究尚未发现其不良反应，但也无足够的证据完全排除理论上可能的危险性，主要表现在二个方面：

1．目的抗原的长期表达以及核酸的直接注射，可能会导致宿主产生免疫耐受及抗DNA抗体或抗自身细胞的抗体。在成年动物接种DNA疫苗未见到诱导免疫耐受状态，但弱抗原基因的DNA疫苗可能产生耐受问题。用疟疾环状子孢子蛋白基因接种2～5d的初生小鼠，可诱导特异性耐受状态。因此，应尽量避免选择低表达抗原或弱免疫原性抗原。目前也尚未发现注射DNA疫苗的动物可产生抗肌细胞抗体及诱发肾小球肾炎，但有自身免疫倾向的N2/B/N2 W小鼠接种DNA后可检测到抗双链DNA抗体。

2．目的DNA有可能整合到宿主细胞基因组中，诱导某些癌基因的表达或抑癌基因的封闭而造成肿瘤的形成。虽然质粒DNA在肌细胞内持续1个月以上，但核酸免疫的剂量较小，所注射核酸中一般没有介导目的基因与宿主基因整合的成分，因此，与其它基因导入法比较，核酸疫苗相对安全。目前尚无因接种核酸疫苗引发肿瘤的报道。

四、核酸疫苗与常规疫苗的比较

  核酸免疫与常规免疫的最大差异在于所使用抗原类型的不同。常规免疫所使用的抗原一般是灭活或减毒活病原体，或病原体的亚单位蛋白。核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段（DNA或RNA)，可提供与天然构象极为接近的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与自然感染过程相似，因此，核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力（表13-1)。

表13-1 常规免疫法与核酸免疫法的比较

常规疫苗（抗原)在血清中代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，需多次加强接种免疫原；而核酸疫苗可在机体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。此外，采用同种不同株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，从而有效地预防病原体极易发生变异的某些疾病（如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等)。

目前，核酸疫苗已广泛用于抗感染、抗肿瘤免疫等研究，已有多种感染性疾病（如乙型病毒性肝炎、艾滋病、流感)的核酸疫苗正在进行临床Ⅰ、Ⅱ期试验，并有望在较短的时间内投放市场。这些疾病所涉及的病原体多种多样，所采用的动物模型从最初的小鼠发展到猩猩等灵长类动物。核酸疫苗除用于预防外，还可能对目前尚无满意疗法的某些疾病（如慢性病毒性肝炎、艾滋病)提供一条新的治疗途径。

第五节 独特型疫苗

独特型（idiotypic，Id)疫苗或称抗独特型抗体（anti-idiotypicantibody ，AId)疫苗，是根据Jerne免疫网络学说而设计的一种新型疫苗。1974年，Jerne发表了著名的免疫网络调节学说，认为宿主受抗原刺激后的免疫调节是通过抗体上的抗原决定簇Id和anti-Id相互反应来进行的。Id分子不仅存在于抗体分子上，也存在于T和B细胞表面的抗原受体上。

将某抗原(Ag)接种至动物体上，可产生抗体（Ab1)；再将Ab1作为抗原接种至另一动物体，可产生抗抗体（Ab2)。抗抗体所针对的抗原表位是抗体分子上的独特型，故Ab2称为抗独特型抗体（AId)。Ab2若接种于人类，则产生Ab3。根据Jerne的理论，Ab1和Ab2互补，Ab2和Ab3互补，Ab3在结构上与Ab1相似，Ab2与Ag相似，可称为Ag的内影像（internalimage)。Ab3应与Ab1具有对Ag相同的免疫反应，若Ag为某病原体的抗原，则Ab3就能对其产生免疫应答（图13-2)。利用Ab2制备的疫苗称为独特型疫苗，亦称内影像疫苗。

 抗原（Ag)  Ab1

相似

  Ab3  Ab2

图13-2  独特型疫苗的理论示意图

独特型通常是单克隆性的，即只限于某个体的一个抗体分子或一个抗体克隆所有。有的独特型可存在于同种异体或异种个体间，是公共或交叉反应性独特型，这种独特型在制备疫苗时具有重要意义。

由于独特型疫苗是用Ab2代替Ag作为免疫原，这就避免了病原体抗原可能对宿主产生的毒性作用，特别适用于对付那些不宜直接对人体进行接种的病原体。同时，为某些尚不能培养或产量很低的病原体，以及免疫原性较弱且不能用重组DNA技术生产的多糖类抗原疫苗的研制提供了另一条有效的技术路线。目前，已用于单纯疱疹病毒、HIV、结核分枝杆菌、肺炎链球菌等病原体疫苗的研制。

第六节 植物疫苗

转基因植物疫苗（transgenic plantvaccine)或植物疫苗(plant-based vaccine)是指将抗原基因导入植物细胞并在其中表达，人食用已表达目的抗原的转基因植物后，可诱发宿主产生特异性免疫应答的新型疫苗，它是20世纪90年代疫苗研究的重大发现之一，已尝试用于多种重组疫苗的研制。转基因植物生产疫苗有两种方法：一是建立整合抗原基因的稳定表达植株，并可通过无性或有性繁殖生产大量的转基因植物；二是建立瞬时表达植株，即利用基因工程植物病毒为载体，将编码疫苗抗原决定簇基因插入植物病毒基因中，再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达，可获得高产量的目的蛋白，如用烟草花叶病毒作表达载体转染植物细胞，瞬时表达目的抗原。

转基因植物作为外源蛋白的反应器生产口服疫苗，具有以下显著的优点：①与动物细胞相比，植物细胞易于培养和进行遗传操作。植物细胞具有全能性，能以细胞团、悬浮细胞或原生质体等形式大量无限地繁殖，植物愈伤组织细胞团和原生质体可再生植株；②许多植物的贮藏器官，如种子胚乳、块茎、果实等，是蛋白质很好的聚积和保存场所，使重组蛋白的生产、运输和储存更为容易，免疫途径更简便、安全；③植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时，可受到细胞壁的保护，直接到达肠内粘膜诱导部位，刺激粘膜和全身免疫，比传统的免疫途径更有效；④用动物细胞生产重组蛋白，常用动物病毒做载体导入抗原基因，对人类有潜在的危险。而植物病毒不感染人，用植物细胞生产重组蛋白更为安全；⑤转基因植物生产蛋白不需严格的纯化程序，更为经济价廉，可望替代传统的发酵生产，有利于疫苗在发展中国家的普及推广。

可用于转基因的植物主要集中在烟草、马铃薯、番茄、水稻等。考虑到婴幼儿的爱好问题，优选那些婴幼儿喜欢的植物如草莓、番茄、香蕉等来制备疫苗，则是植物疫苗能否被推广应用的重要因素之一。有些转基因植物表达的抗原需要纯化蛋白，有些则可直接经口服免疫。

目前在植物中已成功表达乙型肝炎病毒、口蹄疫病毒、痢疾志贺菌、狂犬病病毒、流感病毒等多种抗原。在烟草中表达的HBsAg约为总可溶性抗原的0.01%，获得了22nm的正确组装的HBV颗粒，免疫小鼠后产生与重组抗原相似的免疫效果，提示转基因植物可表达含有激发B细胞及T细胞的目的抗原的表位。有学者研究发现，转基因番茄所表达的HBsAg可诱导特异性的B/T淋巴细胞免疫应答与SIgA粘膜免疫应答。

但转基因植物生产疫苗也存在一些不足：①大多数蛋白质疫苗表达量不高，但可通过改进表达调控系统，如采用强启动子、增强子及调控序列来促进表达；②口服时易被消化，可将疫苗抗原组装成病毒样颗粒的有序结构，以增强抗消化作用；③有些疫苗需将目的蛋白从转基因植物中进行提取，以进行人群的注射免疫，将存在如何大规模提取的问题。

我国“973”及“863”计划都将重大疾病相关的防治措施列为重要的研究领域，医用疫苗和转基因植物研究将是我国生物技术领域要接近或超过国际先近水平的战略重大突破口之一。尽管目前还存在转基因植物的安全性及环境污染等方面的争论，但该研究领域必然是未来国际上争先发展的重要方向之一，也将在疫苗研究中发挥越来越重要的作用。

第七节 乳杆菌疫苗

乳杆菌属(lactobacillus)是革兰阳性、无芽胞的非致病菌，多寄居于人的口腔、消化道和阴道内。在人排泄物中已发现3种乳杆菌：嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌，在食品发酵过程中有重要作用，如酸奶的制作。近年发现，乳杆菌携带许多隐秘的质粒，这为在乳杆菌中进行基因操作提供了条件。

沙门菌作为外源蛋白的载体已广为人知，但它一般不能分泌表达蛋白质，而多数乳杆菌则可分泌蛋白，如酸素A（acidocin A)，因此可作为分泌型表达载体，诱导机体产生较强的特异性免疫应答，特别是局部粘膜免疫应答。

与大肠埃希菌相比，人们对乳杆菌的遗传背景还缺乏足够的认识，但乳杆菌作为口服疫苗有三个主要的优点：价廉、安全和方便，因此，有充分的理由相信乳杆菌能成为一个理想的口服活菌疫苗，直接通过口服酸奶等食物获得免疫效果。1986年，首次证实嗜酸乳杆菌可有效地提高小鼠对沙门菌引起的肠道感染的抵抗力，从而奠定了乳杆菌属作为一种高效的口服疫苗载体系统的理论基础。

利用非致病性的德氏乳杆菌乳亚种（Lactobacillus lactis)作为粘膜免疫的抗原提呈系统，使其能在体外大量表达破伤风痉挛毒素C片段(TTFC)，口服免疫后，能激发保护性的血清抗体反应，并在粘膜部位产生TTFC特异性的IgA。口服能表达炭疽芽胞杆菌保护性抗原的干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei)，不仅能引起系统的免疫反应，还能产生SIgA抗体的局部粘膜免疫，可用于防治炭疽病。重组乳杆菌亦可用于治疗胃溃疡、阴道炎等疾病，并获得较好的免疫保护效果。乳杆菌本身可单独作为微生态制剂，对病原微生物具有拮抗作用，增强机体免疫力。

此外，从乳杆菌中提取拷贝数高、分子量小的质粒，构建高表达的分泌载体。用此克隆系统，将外源基因，如某些营养物质（各种必需氨基酸、维生素)、药物（如抗癌药物、防衰老药物)、生长发育的激素等基因导入乳杆菌中，制成活菌制剂，引入人体内，产生机体所需的外源基因的产物，既可加强营养，又可防病治病。

第八节 治疗性疫苗

早在20世纪初期，Wright等尝试采用灭活疫苗治疗慢性细菌性疾病，如葡萄球菌性皮肤病和慢性淋病，取得较好的效果。但是，随着抗生素的问世和迅速发展，治疗性疫苗(therapeuticvaccine)用于传染病的治疗进入低潮。近年来，由于对病原微生物的致病机制和机体抗感染免疫应答的认识不断加深，微生物持续性感染日趋严重，治疗性疫苗重新成为研究的热点，尤其是针对无理想抗微生物药物或易产生耐药性的微生物感染。

一、治疗性疫苗与预防性疫苗的比较

  预防性疫苗的接种对象是健康人群，其研制多采用模拟自然感染过程的策略，一般为微生物的保护性抗原，成分较单纯，主要用于免疫预防作用，对机体无明显的病理损伤，使用安全可靠，已在世界范围内广泛用于传染病的预防接种，成功地用于预防病原体进化相对保守、自然感染可获得牢固免疫力、保护性免疫主要依赖于中和抗体的疾病，如天花、脊髓灰质炎、麻疹等。

但是，在自然感染不能诱发长时间免疫力而且引起慢性持续性感染的疾病中，模拟自然感染过程的策略难以研制出高效疫苗，原因一方面是细胞免疫比体液免疫更为重要；另一方面部分病原体可通过其不合理的表位或免疫缺陷，加重感染过程和病理过程；病原体（或抗原)含有与各种不同的细胞因子或补体等高度同源性序列，从而干扰细胞间通讯，产生免疫颠覆（immune subvertion)，因而病原体可逃避宿主的免疫清除而处于病原携带状态或持续性感染状态。

治疗性疫苗的接种对象是持续性感染患者或带菌者，其组分不像预防性疫苗那样单纯，可根据需要进行组合和调整，如用微生物抗原基因与不同细胞因子基因组成并表达的嵌合性疫苗。治疗性疫苗旨在启动Th1极化和有效的细胞免疫，打破机体的免疫耐受，提高对病原体特异性免疫应答水平，故特别强调佐剂的选用。由于治疗性疫苗属于免疫治疗，可能伴有免疫损伤，有一定的不良反应。

二、作用机制

治疗性疫苗分为特异性及非特异性疫苗两种。卡介苗属于非特异性疫苗，可刺激T/B细胞增殖，激活巨噬细胞，促进NK细胞杀伤肿瘤细胞，从而发挥免疫增强作用，协助药物清除病原微生物。卡介苗亦可作为肿瘤的辅助治疗用药，可增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。

但大多数特异性治疗性疫苗的作用机制目前还不甚清楚。疫苗疗法的反对者不相信疫苗能改善天然免疫应答，因为患者体内已存在大量的微生物抗原，免疫系统已尽全力，尚不能消灭入侵者，再给机体注入抗原，根本发挥不了作用。最合理的办法是用药物直接攻击入侵的病原体。

但是，支持者认为，治疗性疫苗的作用不同于患者体内的微生物抗原，它通常是由大剂量高度纯化的微生物抗原和提高免疫功能的其它成分组成，抗原量大，免疫原性强，可通过不同的途径将微生物抗原提呈给免疫系统，能更有效地诱发特异性免疫应答，打破免疫耐受状态，部分纠正机体的免疫缺陷，达到清除病原体的目的。例如，对于麻风、结核及病毒等胞内寄生微生物，由于机体不能有效地诱发细胞免疫应答而导致持续感染，治疗性疫苗则可改善患者的免疫状态，刺激机体产生特异性细胞免疫应答，达到清除病原体、防止复发的目的。

三、研制策略

设计治疗性疫苗的抗原时，可考虑用模拟抗原（mimogen)代替天然抗原，从而克服机体对天然抗原的耐受性，同时选用合适的佐剂。主要策略有：

打破免疫耐受  研究发现，用HBsAg制成的治疗性疫苗可引起抗原提呈细胞提呈抗原，表达协同刺激分子，诱发特异性CTL细胞反应，从而打破免疫耐受，使相当一部分患者体内病毒复制停止或消失，达到治疗目的。

据报道，对46例HBsAg及HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者注射3剂HBV疫苗，每月1次，半年后，12例患者HBV DNA阴转，另8例HBVDNA水平显著下降。用IFN治疗12例应答者中的6例，4月后HBV DNA仍为阴性；34例无应答患者中的20例给予IFN治疗，2例给予阿糖腺苷，结果12例HBVDNA阴转，可见，在抗病毒药物治疗前给予HBV 疫苗，对大幅度降低HBV DNA水平，为乙型肝炎的治疗提供一条价廉、高效、安全的途径。

研究证实，HBV DNA疫苗与IL-2、IL-12和GM-CSF等细胞因子基因联合注射后，可诱发强烈的Th1型免疫应答，CTL活性增强。治疗性HBV疫苗可在CTL水平打破HBV感染后的免疫耐受。我国学者已开展乙肝疫苗联合猪苓多糖、人抗-HBsIgG、干扰素、胸腺素等治疗慢性乙型肝炎，获得了较好的效果，疗效比单独用药好。

引起保护性免疫应答  很多慢性感染中自然感染后产生的免疫应答往往为非保护性，如幽门螺杆菌（Hp)主要诱发Th1型细胞免疫，产生大量IFN-γ（参见第9章)。IFN-γ对胞内菌感染的清除非常重要。但是，由于免疫细胞难以接近Hp感染的胃粘膜上皮细胞，故IFN-γ不能清除胞外菌Hp，反而造成组织损伤。采用减毒沙门菌为载体，表达Hp尿素酶B亚单位，制成活载体疫苗，口服后能引发强烈的Th2型细胞免疫应答，而不加重组织损伤，达到治疗目的。

在控制胞内菌感染上，与Th1型细胞相关的CTL和IFN-γ非常重要。DNA疫苗、活载体疫苗或减毒活疫苗可诱导Th1型细胞免疫，诱发CTL产生保护性免疫应答，因此可作为治疗性疫苗。

通过表达人乳头瘤病毒（HPV)的 L1E7 融合蛋白，制备一种嵌合的病毒样颗粒（virus-like particle, VLP)，免疫动物后可诱发针对L1样颗粒的中和抗体应答及E7特异性T细胞应答，表明VLP疫苗适于治疗HPV感染。

由于目前很多传染病（如HIV、HCV、HBV感染等)、肿瘤等尚无有效的治疗药物，而治疗性疫苗的不良反应比化疗药物少，因此，治疗性疫苗与药物治疗可协同作用，提高机体的特异性免疫应答水平，加速康复，减少复发。治疗性疫苗已在乙型肝炎、艾滋病、麻风、结核、布鲁菌病、疱疹等疾病的治疗中发挥了www.med126.com一定作用。

疫苗研制属于高技术生物药物开发范畴。FDA的报告显示，疫苗增长非常迅速，年增加品种达到44%，分别用于癌症、艾滋病、乙型肝炎、类风湿关节炎、帕金森征等疾病的治疗。国外权威专家预测，未来的生物技术重磅炸弹生物药品将由5类组成：单克隆抗体、反义核酸、基因治疗药物、可溶性蛋白质类药物、疫苗（特别是治疗性疫苗)。可见，治疗性疫苗具有广阔的发展前景，但对其安全性必须予以高度重视。

第九节  疫苗佐剂

一、定义

早期对疫苗佐剂的认识仅限于佐剂可提高特异性抗体的水平，研究的着眼点放在B淋巴细胞系统，将能与抗原结合并非特异性地增强抗体应答的物质称为佐剂（adjuvant)。但是，随着对免疫佐剂作用机制、免疫细胞及免疫活性分子的深入了解，发现除体液免疫（B细胞系统)外，细胞免疫（T细胞系统)在调节机体免疫应答方面也有非常重要的作用。例如，Th细胞能识别与MHCⅡ类分子相关的抗原决定簇，涉及对宿主细胞中不能合成的抗原（如大多数细菌抗原)的免疫应答；Tc细胞能识别与MHCⅠ类分子相关的抗原决定簇，涉及对宿主细胞合成的抗原（如病毒某些抗原)的免疫应答。

因此，理想的免疫佐剂除了可刺激B细胞产生能直接识别外来抗原的抗体外，尚要求能调动T细胞系统的功能。佐剂可定义为：能调动整个免疫系统的功能，非特异性地作用于抗原而增强或延长其特异免疫原性的物质。

近年来，人们大量使用生物合成、基因重组及其它手段制备的纯化亚单位疫苗或合成疫苗，但这些疫苗的免疫原性很弱，需要佐剂的帮助才能有效地诱发高水平免疫应答。传统的佐剂如氢氧化铝具有很多本身无法克服的缺陷，如使用后发生炎症反应等，促使人们研制新的佐剂系统。目前，佐剂在提高机体抗病毒免疫、抗肿瘤免疫、保持免疫网络稳定方面的作用日益受到关注。

二、作用机制

免疫调节作用  主要指佐剂调节细胞因子网络的能力，可上调或下调某些细胞因子的表达。此类佐剂与免疫原分开注射也有效。人与小鼠的CD4^＋Th细胞经适当刺激后，分化成Th1和Th2两个亚群。前者偏向于分泌IL-2、IL-12和IFN-γ，可促进细胞介导的免疫应答和B细胞产生小鼠IgG2a（相当于人IgG1)抗体；后者偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，促进B细胞产生高浓度的IgG1和IgE抗体，增强抗体介导的免疫应答。目前，衡量佐剂的效能不再只看所诱生抗体的总水平，而需看诱生抗体的质量，即抗体的亚类和亲和力。

佐剂免疫调节作用还可通过改变抗原的理化性质、结构重组、表位暴露等（如脂质体)，活化补体（如葡聚糖)，诱导粘附分子、辅助刺激因子、结合蛋白等免疫生物活性分子的表达（如多糖)，诱导 T及B淋巴细胞的免疫记忆（如CT、CT-B、脂质体)。

提呈作用及靶向作用  佐剂通过刺激单核-巨噬细胞，增加对抗原的处理和提呈能力。抗原提呈细胞(APC)主要是树突状细胞(dentritic cells，DC)、巨噬细胞(Mφ)及B细胞等。佐剂刺激APC表达IL-l，后者吸引CD4^＋T细胞移向APC，T细胞受体（TCR)与抗原肽-MHC复合物互补结合，可促进T细胞的克隆增殖，此阶段可能发生Th1／Th2型免疫应答的转变。选择靶向Mφ还是DC，所产生的免疫应答类型将有实质性变化。最新研究表明，缺乏Mφ将使应答转向Th2型。

目前认为，B细胞SIg识别抗原的构象决定簇，T细胞识别结合在MHC分子上的短肽，因此，有效的疫苗需要保持决定簇的构象，应选用非变性佐剂如Syntexadjuvant formation(SAF)。而氢氧化铝佐剂会导致抗原变性而丧失构象，弗氏（Freund )佐剂乳化的抗原所诱导的抗体一般只识别抗原内部决定簇而非构象决定簇。

诱导CD8^＋CTL应答  诱导CTL的佐剂应能促进多肽与MHCⅠ类分子结合。最有效方法是使佐剂与APC膜发生反应，在膜融合时将与佐剂结合的抗原贮存于细胞质中，诱导IFN-γ表达，以提高抗原肽-MHCⅠ类分子水平。诱导CTL的另一机制是CTL识别的肽直接结合到空的、外露的MHCⅠ类分子。

抗原储存作用  短期贮存的佐剂有铝盐和油包水乳剂，注射8～10d后切除注射部位，对应答强度和持久性无影响，提示此时抗原已被清除或屏蔽。长期储存则提供持续和脉冲式抗原释放，最好的是合成多聚体微球，直径≥10μm，其包含成分(免疫原和佐剂)可存留于注射部位直到被APC生物降解清除，释放时间为1～6个月。

改变抗原分子的物理性状  根据抗原分子物理性状不同，可将其分为可溶性和颗粒性抗原。通常颗粒性抗原更有利于APC的内吞及吞噬，稳定性较好。T细胞免疫佐剂可改变抗原分子的物理性状或增加其分子量、或变可溶性抗原为颗粒性抗原或形成抗原微库(antigenmicroreservoir)。

表位外显及空间限构抗原分子的易接近性(accessibility)是决定该抗原分子免疫原性强弱的重要因素之一。天然蛋白抗原由于存在空间障碍(stereohindrance)，许多有效的抗原表位不能外露，易接近性较差。基因工程的发展及人工合成肽技术的应用，使人们可能有目的地表达或合成某一抗原表位。然而，如何外显这些表位，避免其相互集聚形成新的空间障碍十分重要。T细胞免疫佐剂增强抗原免疫原性的一个重要机制就是使抗原表位外显。

三、佐剂的分类及应用

佐剂一般可分为：①颗粒型佐剂：包括铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体、纳米和微米颗粒、钙盐、蛋白体、病毒体等；②非颗粒型佐剂：包括胞壁酰二肽(MDP)及衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、糖类聚合体、多糖衍生物、细菌毒素等。

（一)多糖佐剂

免疫原性较弱的抗原往往是病原体的多糖抗原，一般包括菌体多糖和荚膜多糖。研究证实，许多细菌的多糖抗原均为保护性抗原，如B型流感嗜血杆菌荚膜多糖、伤寒沙门菌的Vi抗原、铜绿假单胞菌菌体多糖等。这类抗原均属于T细胞不依赖型抗原（Ti-Ag)，在宿主的免疫应答中仅产生IgM，无记忆B细胞形成，不产生加强应答，因此，免疫原性弱，须和蛋白质结合加强其免疫原性，才能达到理想的免疫效果。将免疫原性弱的抗原与免疫原性强的抗原结合而成的疫苗称为结合或偶联疫苗（conjugatevaccine)。

在设计和制备结合疫苗时应考虑以下因素：①多糖抗原的选择，依据细菌的保护性抗原是荚膜多糖还是菌体多糖而定；②多糖分子的大小，选择天然多糖或经降解后的寡多糖；③载体蛋白的选择；④结合方式，2个抗原可采用直接结合或通过化学联结剂结合等。结合疫苗中二种抗原经化学共价键结合后，免疫原性均得到增强，不仅起到联合接种的目的，还同时提高了免疫接种效果，特别是在儿童中免疫接种效果尤为显著，已成为儿童疫苗研制的一个热点，其中最成功的结合疫苗是流感嗜血杆菌荚膜多糖结合疫苗。

作为一种可供人用的有效疫苗，必须具备二大特性：①结构特性：包括多糖抗原和载体蛋白之间以化学共价键牢固地结合；多糖分子大小及其与载体蛋白的结合比例，有利于刺激宿主产生最强的针对多糖的免疫应答；重复制备性及稳定性好，有效期较长；易于标准化；②功能特性：包括无毒、安全；不引起宿主产生超敏反应和组织排斥反应；注射宿主后能同时诱发细胞免疫与体液免疫等。

（二)聚合物佐剂

理想的疫苗除了免疫效果良好、制作工艺简便外，最好单次免疫后能提供完全、长期的保护作用，以降低疫苗制备成本和接种费用，易于推广应用。但是，目前所用的疫苗需再次或多次接种来加强免疫效果，不利于疫苗在发展中国家、城市暂住人口及农村地区的儿童中推广。最有效的解决办法是，发展一次免疫就能达到长期保护作用的单针疫苗。

单针疫苗实际上是一种能控制免疫原定期释放而模拟反复免疫的一种新型疫苗，其本质是对常规疫苗进行加工，使之进入宿主后能长期稳定地释放免疫原，达到多次免疫的目的。

目前，脂质体、单层囊、乳剂及聚合物都可作为单针疫苗的佐剂，其中以聚合物（polymer)最具开发价值。最常用的聚合物有聚乳酸乙醇酸(PLGA)、丙烯酸聚合物、聚氰基丙烯酸酯(PACA)等，其中PLGA是一种可注射的生物降解聚合物，也是唯一获得FDA批准使用的人工合成生物降解聚合物。它具有疏水性和淋巴定向性，非酶性水解，可通过改变其分子量或单体构成比例调整其缓释来控制免疫效果。

以聚合物包裹疫苗抗原而制备的单针疫苗又称为微囊疫苗（microcapsulizedvaccine)，亦称可控缓释疫苗（controlled slow release vaccine)。在制备时利用有机溶剂将PLGA-抗原-有机溶剂溶液与水或硅油中的乳化剂混合，使抗原包裹于PLGA微球中，干燥去除残余有机溶剂后，以干粉形式储存。当干燥微球再水化时，微球表面及附近的抗原就可以扩散到微球周围的介质或组织中，随后抗原继续扩散出微球（持续释放)，或因缺乏抗原扩散孔或通道而进入滞留期（脉冲释放)。一段时间后，水催化PLGA的酯水解，形成大量抗原扩散孔并进入第二次扩散期，从而达到抗原持续释放或脉冲释放的目的。据报道，通过调整PLGA的制备方法及疫苗抗原的含量，可以使两次抗原扩散时间间隔达1～6个月。一般认为，以口服微囊疫苗的免疫效果较好。

据国外报道，将HIV-1的gp120制成微囊疫苗，接种动物后产生的病毒中和抗体应答，与gp120亚单位疫苗反复免疫的效果相似，一次接种后诱生的中和抗体应答可持续1年。疟疾传播阻断抗原(TBV25H)疫苗用常规明矾作为佐剂，免疫3次后仍不能诱生完全保护，而用TBV 25H PLGA微囊疫苗免疫1次，在抗原脉冲释放约40d后就可诱导完全保护。

单针疫苗具有许多常规疫苗所没有的特点，但仍需不断完善，例如，包裹抗原的量与微囊大小的最佳比例，微粒制备方法不同对抗原释放的影响，抗原的长期释放可能导致的免疫耐受，微囊疫苗在体内生理条件下的稳定性，人用微囊的无菌处理以及局部注射可能造成的局部炎症反应等。不过，单针疫苗作为一种新型疫苗，将有望替代现有反复免疫的疫苗。

（三)细菌毒素佐剂

霍乱肠毒素（CT)、大肠埃希菌不耐热肠毒素（LT)已被广泛用作口服疫苗的粘膜佐剂。

超抗原（superantigen, SAg)是一类特殊的抗原，是功能异常活跃的蛋白质分子（参见第3章)。与普通抗原相比，它具有以下特点：①不需要抗原提呈细胞加工提呈，可直接与MHCⅡ类分子结合形成复合体，进一步与TCRVβ区结合形成三聚体，并激活多克隆T细胞。SAg能非特异激活大量T细胞，它不遵循传统的抗原提呈途径，不同SAg结合的MHCⅡ类分子的独特型及亲和力不同；②SAg对T细胞的激活频率高达5%～30%，比普通抗原高10³～10⁵倍，因此极微量的超抗原（pMol数量级)就能诱导宿主产生强烈的免疫应答；③能同时激活CD4⁺T和CD8⁺T细胞，诱导细胞和体液免疫应答。

根据SAg和TCR、MHCⅡ类分子作用的分子机制，有人提出超抗原疫苗（Superantigenvaccine)的新思路，即通过诱变或修饰超抗原分子，降低其与MHCⅡ类分子和TCR Vβ区的亲和力，使其失去超抗原的毒性作用，但能诱导具有天然超抗原特异性的保护性抗体，可结合天然超抗原，用于防治超抗原介导和引起的疾病。

寻找理想的减毒突变体和采用合适的体内外模型评价SAg毒性是超抗原疫苗研究的关键。细菌外毒素因作用机制相对简单，已成为SAg疫苗研究的主要对象，例如，通过位点定向诱变获得一系列与TCR或MHCⅡ结合减弱的链球菌致热外毒素A（SEA)突变体，均诱导出高水平的抗SEA抗体，用天然SEA攻击后，免疫动物可获得保护。

尽管对超抗原疫苗的研究还处于起步阶段，但其特殊的免疫学特性必将为AIDS、肿瘤和自身免疫病等人类顽固性疾病的防治开辟一条新途径。

（四)免疫球蛋白佐剂

双特异抗体(bispecific antibody，BsAb)，又称双功能抗体，是指抗体分子表面具有两个不同的抗原结合位点，可同时与两种不同的抗原结合。传统意义上的抗体是单特异的，只能与一种抗原结合，具有单特异双价的特征，而BsAb是双特异单价抗体。BsAb在体内导向（抗肿瘤药物、毒素、放射性核素、抗原等)及体外免疫组化、免疫化学分析中均有广阔的应用前景。

用 BsAb定向运送抗原至 APC，增强抗原免疫原性及抗体应答反应的机制尚不十分清楚，可能是：抗体能够聚合浓缩抗原，在聚合状态下，抗原决定簇(表位 )更集中；被抗体聚合成团的抗原较可溶性抗原更易被吞噬细胞吞噬，有利于抗原的加工处理。双特异抗体作为一种很好的抗原定向运送系统，避免了佐剂无法克服的炎性反应等不良反应，且能极大地增强抗原的免疫原性及抗体应答水平，为今后疫苗佐剂的研究提供了一条新思路。

（五)CpG DNA佐剂

CpG特征结构是以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG)为基序（motif)的回文序列，5＇端为2个嘌呤，3＇端为2个嘧啶，即一般遵循5′-PuPuCGPyPy-3′方式。CpG序列可激活多种免疫效应细胞，故又称为免疫刺激DNA序列（immun-stimulatoryDNA sequence, ISS)。

CpG岛在细菌、病毒基因组中含量较高，而在脊椎动物DNA中出现频率仅为细菌的1/4，并且80%以上CpG的胞嘧啶高度甲基化。这种显著差异可能是使CpG基序成为免疫刺激信号的基础，提示在长期进化过程中，动物机体可能形成一种通过识别非甲基化CpG基序来防御病原微生物感染的免疫机制。不过，单纯的CpG基序不足以激活免疫细胞，其侧翼序列也是不可缺少的。

含有CpG基序的DNA片段是一种强烈的非特异性免疫刺激剂，可作用于多种免疫细胞。研究表明，CpGDNA可能经吸附内吞作用，被B细胞或单核细胞摄取，进入细胞内酸性空间，诱导细胞内活性氧成分（reactive oxygen species，ROS)产生。ROS作为一种细胞内第二信使，引起IκB等因子的磷酸化及降解，激活NF-κB。活化的NF-κB介导调控多种细胞因子的表达，从而发挥多种免疫效应（参见第4章)。

CpG DNA可直接激活B细胞，IL-6 mRNA含量明显增加，呈全身系统性分泌，而IL-6在免疫调节中发挥重要作用。同时，CpGDNA可直接激活B细胞和单核细胞（包括巨噬细胞和树突状细胞)，上调细胞表面MHCⅡ类分子和协同刺激因子（如CD80、CD86)的表达，分泌Th1型细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12等，但无IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等产生，提示CpGDNA主要诱导产生Th1型免疫应答，或调节Th2型免疫应答向Th1型转变。此外，CpG DNA在单核细胞分泌的细胞因子作用下，可提高T细胞因子和细胞毒性反应。

Th1型免疫应答能增强宿主对微生物感染（尤其是胞内病原体)的免疫应答和防御功能，而Th2型应答则与感染的进展、持续性和慢性化有关。弗氏佐剂可产生强Th1型免疫应答，但不良反应使之仅局限于动物疫苗。铝化合物佐剂是目前唯一允许用于人体的佐剂，但主要诱导Th2型免疫应答而不是Th1型。CpGDNA能诱导强烈的抗体应答和Th1型细胞免疫，因此，有望成为应用于人体的新型佐剂，其主要用途有：

1．抗微生物感染疫苗制备：常规的蛋白质疫苗和死疫苗作为外源性抗原被免疫系统处理后，由于缺乏MHCⅠ类分子提呈，不能诱导CTL反应。CpGDNA和蛋白质抗原共同免疫动物后，可诱发强烈的Th1型细胞因子和CTL反应。将CpG DNA插入载体内部或外源性与DNA疫苗共注射，均可增强疫苗免疫原性，提高抗体免疫应答水平。例如，在HBVDNA疫苗中加入CpG DNA，可大大加速血清抗原阴转，提高抗体效价。CpG DNA亦是流感疫苗的有效的粘膜免疫佐剂。

2．肿瘤免疫治疗：CpG DNA能激活NK细胞和巨噬细胞，并诱生多种细胞因子如INF-γ，提高ADCC作用，从而抑制肿瘤的生长，是肿瘤疫苗的有效佐剂。用IL-2和抗肿瘤单克隆抗体重复注射肿瘤小鼠，存活率只有40%；而协同使用CpGDNA及抗肿瘤的单克隆抗体后，小鼠存活时间显著延长，存活率也大大提高。此外，CpG DNA的佐剂效果与GM-CSF有很强的协同作用，可诱发强烈的Th1型免疫应答。

3．阻止变态反应的发生：过敏反应及其相关疾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病、哮喘等与Th2型免疫应答密切相关。CpGDNA为过敏性疾病的治疗开辟了新前景，它能诱导机体产生较强的抗原特异性Th1型反应，抑制Th2型反应，降低IgE的合成及嗜酸细胞的活化。研究发现，将CpGDNA与抗原同时饲喂对此抗原已致敏的小鼠，结果CpG DNA通过将免疫应答转变为Th1型而消除了以Th2型细胞因子为特征的变态反应。CpG DNA提前注射比与过敏性抗原同时注射效果更好。

总之，CpG DNA增强免疫活性的发现拓展了人们对DNA生物学功能的认识。随着对其免疫作用机制逐步深入的研究，将有望获得一种安全高效的人用的新型疫苗佐剂。

（六)脂类分子内佐剂

脂类分子内佐剂分子的基本构想是：在抗原肽的末端共价连接一脂类集团，形成稳定的脂肽分子—脂肽疫苗，免疫原性得以提高，在体内有效地诱发抗原特异性免疫应答。脂肽分子在水溶液表面形成粘滞性单层分子，其脂链迅速与脂膜结合，以脂质为载体通过跨膜作用或肽抗原识别膜受体作用，将抗原肽导入细胞内，进入抗原提呈途径，快速发挥生物学效应。

最早使用的分子内佐剂为人工合成的三棕榈酰丝氨酰甘油基半胱氨酸（P3CSS)，它有良好佐剂性，可与抗原肽共价连接。α-氨基十六烷酸亦可作为分子内佐剂，可与HIV-1gp160包膜蛋白的CTL表位肽共价连接，无需其它物质配合使用，即可刺激Th细胞增殖，并诱导CTL反应。脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，具有无毒、无免疫原性、易于被组织吸收、可被生物降解的特点，是一种多功能载体。脂质体作为疫苗佐剂，可保护DNA疫苗免受核酸酶降解，将目的基因DNA特异传递到靶细胞中，可同时增强机体的体液免疫和细胞免疫。

目前，脂类分子内佐剂已成为免疫学研究，特别是在B、T细胞表位图谱测定、抗病毒感染等有效工具，除高效、安全、耐受好、成本低等优点外，还具有以下特点：①佐剂为大肠埃希菌天然免疫活性蛋白的N-端脂肽或其它脂类分子，肽脂疫苗以膜锚复合物形式存在，对光、热、溶剂性质等高度稳定，分子量小，易被抗原提呈细胞（APC)摄取；②由于脂链的亲脂膜特性，肽脂疫苗可迅速被细胞摄取或形成微胶粒沉淀，从而不会被血浆/组织中的酶迅速降解；③其代谢产物为无害氨基酸、脂肪酸及可经粪、尿排出的代谢中间产物。

（七)细胞因子

细胞因子（cytokine)可通过不同环节调节和增强DNA疫苗的免疫反应。IL-2、IL-12以增强Th1型细胞免疫为主，GM-CSF以增强体液免疫为主。DNA疫苗中加入细胞因子基因，对疫苗的免疫应答有显著的影响。若需要使Ｔ细胞反应增强，可选用IL-2基因与DNA免疫原共注射；要制备针对胞外菌的DNA疫苗，可选用IL-4、IL-5、IL-10基因共注射；若需CD4^＋Th细胞、抗体在免疫保护上均起作用，可共注射GM-CSF和IL-2基因；若Th细胞、抗体、CTL均需加强，可选用TNF-α基因共注射。

质粒载体中插入细胞因子基因可增加外源基因表达产物诱导的免疫反应。例如，将HBsAg和IL-2基因共表达或共注射，可使抗体产生和Th细胞反应增加；又如，将编码IL-6的质粒与编码马流感病毒血凝素的质粒共同注射小鼠，可使小鼠获得完全保护。

IL-12是目前发现对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子，在肿瘤、病毒性疾病及自身免疫性疾病的治疗中起主要作用。IL-12可增强DNA疫苗的免疫效果，在增强特异性外源蛋白免疫应答方面具有明确的作用。把IL-12p35和p40基因与HCV C 蛋白或C-E1-E2蛋白重组后，肌肉注射免疫BALB/c小鼠，发现其脾脏明显增大，且特异性CTL水平显著升高，可提高约3倍，但特异性抗体应答降低，提示IL-12在加强细胞免疫的同时，减弱了体液免疫应答，改变了质粒DNA的应答形式。

（八)免疫刺激复合物

免疫刺激复合物（ISCOMs)是以皂角苷QuilA为基础，通过表面疏水作用，与多个亲水和疏水基团的两性抗原分子及脂质分子交联，形成直径约30～40nm的球形笼状颗粒，类似膜表面抗原构造。这样一方面固化了抗原分子，同时也较好模拟体内识别抗原的微环境。这种结构变可溶性抗原为颗粒性抗原，加强抗原粘附、吞噬。在体液环境中增强了与抗原提呈细胞膜相互作用，其摄入量比同样大小的颗粒抗原高达50倍以上，有效地诱导Th克隆增殖、高滴度抗体应答和CTL应答，发挥T细胞免疫佐剂的作用。近年来，临床上将ISCOMs作为非特异性免疫增强剂，用于抗肿瘤和慢性感染的辅助治疗。

疫苗佐剂性与非特异免疫应答之间并无明确的界限，新型免疫佐剂研究的主要内容之一是探讨二者之间最佳的平衡。新型免疫佐剂诱导机体的非特异性免疫应答过强或过度泛化，必然转化成免疫病理过程，出现一系列毒副作用。因此，应进一步提高新型免疫佐剂作用的靶向性，控制机体产生的免疫应答的强度和类型，这无疑会具有重要理论意义和实用价值。

采用不同理化性质的免疫佐剂，通过免疫药理学手段，改变免疫途径和方式，设计疫苗及佐剂传递系统，采用抗原与佐剂不同的结合方式，用不同表位抗原等，虽用同样的抗原，完全有可能激活不同的免疫效应细胞，诱生不同的免疫生物活性分子，产生不同强度（量)和不同类型（质)的免疫应答。

第十节  存在问题及发展方向

1998年，WHO在“疫苗研究及发展”报告中指出，目前微生物疫苗的研制中存在的主要问题是改进免疫方法，简化免疫程序，提高疫苗的稳定性及安全性，以及降低疫苗的生产成本。

许多疾病可通过接种疫苗来预防，目前几种重要的候选疫苗或有待改进的疫苗涉及的病原微生物主要包括：①青少年易感的病原体：如巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体等；②成人易感的病原体：如流感病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、葡萄球菌和幽门螺杆菌等；③地区流行的病原体：伤寒沙门菌、霍乱弧菌、肠产毒性大肠埃希菌、麻风杆菌、登革病毒、森林脑炎病毒、汉滩病毒、黄热病毒等。

目前，抗病毒治疗仍不尽人意，而疫苗免疫可降低多种急性传染病的发病率和病死率，保障儿童健康。WHO在 20世纪70年代提出了扩大免疫规划（expandedprogramme on immunization，EPI)，计划在1996～2000年＜ 1岁儿童至少 90%以上获得百白破、脊髓灰质炎、结核、麻疹四苗免疫接种，我国四苗接种覆盖率县以上单位已达到85%以上。WHO将在全世界实施“全球疫苗与免疫规划”（global programme for vaccines and immunization，GPV)，在今后的20年中，各国应优先发展破伤风、麻疹、乙型肝炎、艾滋病、黄热病、风疹和流感嗜血杆菌疫苗，以及能使6个月内新生儿得到保护的其它新生儿用疫苗。应根据病毒感染性疾病的流行动态和发展情况，研制新的疫苗种类和实行联合免疫，研制同时激发体液免疫和细胞免疫的新型疫苗，将疫苗的功效从预防疾病进展到兼有治疗作用的治疗性疫苗。

预计在21世纪初，经过疾病预防和治疗效果的验证，基因疫苗将会走向市场，仍将是疫苗研究热点。研究的趋势可能是：寻找延长基因疫苗的活性并使其产生更强的免疫效应的方式，确定最佳的注射方案和剂量，针对特定的病原体从数千种基因中选择出最有效的基因制成疫苗，确定基因疫苗在需要时刺激强烈的细胞免疫应答的措施，寻找出增加整体免疫反应，以及使细胞与体液免疫应答关系最优化的途径。

今后疫苗佐剂发展的一个新动向是将抗原定向地传递给抗原提呈细胞，如单核-吞噬细胞等，以便更好地对抗原进行处理和提呈，避免T细胞耐受产生，极大地增强抗原的免疫原性，刺激机体产生更强的免疫应答，特别是细胞免疫应答。人用佐剂是未来研究的重点之一。

总之，疫苗的发展是一项长期的、需国家政府参与的、高投入、高产出的产业。随着生物技术的发展和对各类微生物认识的不断加深，成功预防及控制各类传染病和微生物的感染将不再遥远。

（陈  元  中山大学中山医学院)

（黄建生  第一军医大学)