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医学微生物学-电子教材:螺旋体
来源:河北医科大学 更新:2013/10/14 字体:
 

螺旋体

 
 

螺旋体(spirochete)是一类细长、柔软、螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。其基本结构与细菌相似,例如有细胞壁、原始核质,以二分裂方式繁殖和对抗生素等药物敏感等。因此,分类学上划归广义的细菌范畴。
  螺旋体在自然界和动物体内广泛存在,种类很多。根据螺旋体的大小,螺旋数目、规则程度及螺旋间距等,螺旋体目可分为两个科。螺旋体科(Spirochaetaceae)又分5个属,而钩端螺旋体科(Leptospiraceae)分2个属。7个菌属中,密螺旋体、疏螺旋体和钩端螺旋体3个菌属能引起人类的有关疾病。
   第一节 密螺旋体属
  密螺旋体的螺旋细密、规则、两端尖,数目较多;包括致病性和非致病性两大类。对人致病的密螺旋体有苍白密螺旋体(T.pallidum)和品他密螺旋体(T.carateum)两个种。苍白密螺旋体又分3个亚种:苍白亚种(subsp.pallidum)、地方亚种(subsp.endemicum)和极细亚种(subsp.pertenue),它们分别引起人类梅毒、地方性梅毒和雅司。品他密螺旋体引起人类品他病。梅毒是性病,其他3种不是性病。
  一、苍白密螺旋体苍白亚种
  俗称梅毒螺旋体。人体是唯一宿主。
  生物学性状
  1.形态与染色 直径0.10-0.15μm,波幅0.3μm,波长0.6μm,全长7-8μm。有8-14个致密而规则的小螺旋,两端尖直。运动活泼。
  电镜下观察,有细胞壁和细胞膜。细胞壁外尚有包膜,细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。圆柱体上紧绕着3-4根周浆鞭毛(periplasmicflagella),也称轴丝或内鞭毛(endoflagella),与运动有关。运动方式多样,有移行、曲伸、滚动等。
  革兰染色呈阴性,但不易着染。Fontana镀银染色法可将螺旋体染成棕褐色,在光镜下易于查见。新鲜标本不用染色,在暗视野显微镜下,可观察其形态和运动方式。
  2.培养  苍白密螺旋体苍白亚种不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。在家上皮细胞培养中能有限生长,繁殖慢,约30h才分裂一次,并只能维持数代。原认为该螺旋体严格厌氧,后发现在含3%-4%氧时生长最宜。
  3.抵抗力  苍白密螺旋体苍白亚种的抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感。加热41.5℃经1h死亡,在50℃时5min死亡;血液中的苍白亚种螺旋体,在4℃置3d后可死亡,因此4℃血库存放3d以上的血液无传染梅毒的危险。苍白亚种螺旋体离体后1-2h将死亡。对常用化学消毒剂亦敏感,1%-2%石炭酸内数分钟就死亡。对青霉素四环素红霉素或砷剂均敏感。
  致病性与免疫性
  1.致病物质 苍白密螺旋体苍白亚种在体外细胞www.med126.com/sanji/培养中不可能大量繁殖,因而难以检测其毒性物质。近来利用分子生物学技术,将其不同基因克隆到大肠埃希菌,然后研究各个基因产物有无致病性。迄今已发现有些基因产物只存在于有毒菌株。例如有毒株产生可与宿主细胞表面发生粘附作用的外膜蛋白;产生透明质酸酶,利于菌扩散到血管周围组织。有毒株尚能以宿主细胞的纤维连接蛋白复盖于其表面,以保护菌体勿受宿主吞噬细胞的攻击。梅毒中出现的组织破坏和病灶,主要是患者对该螺旋体感染的免疫损伤所致。
  2.所致疾病  自然情况下,苍白密螺旋体苍白亚种只感染人类,人是梅毒的唯一传染源。梅毒有先天性和获得性两种,前者从母体通过胎盘传染胎儿,后者主要经性接触传播。
  获得性梅毒,临床上分为三期。
  ⑴Ⅰ期(初期)梅毒:感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳。多见于外生殖器,其溃疡渗出液中有大量苍白亚种螺旋体,感染性极强。一般4-8周后,硬下疳常自愈。
  ⑵Ⅱ期梅毒:发生于硬下疳出现后2-8周。全身皮肤、粘膜常有梅毒疹,全身淋巴结肿大,有时亦累及骨、关节、眼及其他脏器。在梅毒疹和淋巴结中,存在有大量苍白亚种螺旋体。初次出现的梅毒疹经过一定时期后会自行消退,但隐伏一段时间后重又出现新的皮疹。Ⅰ、Ⅱ期传染性强,但破坏性较小。
  ⑶Ⅲ期(晚期)梅毒:发生于感染2年以后,亦可长达10-15年的。病变可波及全身组织和器官。基本损害为慢性肉芽肿,局部因动脉内膜炎所引起的缺血而使组织坏死。Ⅲ期梅毒损害也常进展和消退交替出现。皮肤、肝、脾和骨骼常被累及,病损内螺旋体少但破坏性大。若侵害中枢神经系统和心血管,可危及生命。
  先天性梅毒,又称胎传梅毒。系母体苍白亚种螺旋体通过胎盘进入胎儿所致,多发生于妊娠4个月之后。苍白亚种螺旋体经胎盘进入胎儿血流,并扩散至肝、脾、肾上腺等大量繁殖,引起胎儿的全身性感染,导致流产早产或死胎;或出生梅毒儿,呈现马鞍鼻、锯齿形牙、间质性角膜炎、先天性耳聋等特殊体征。
  3.免疫性  梅毒的免疫是感染性免疫,即有苍白亚种螺旋体感染时才有免疫力,一旦螺旋体被杀灭,其免疫力亦随之消失。例如Ⅰ期梅毒时,硬下疳未经治疗自愈后,患者再次感染时,不再形成硬下疳。因此时期螺旋体已经入血呈菌血症状态,感染仍是存在,只是处于潜伏状态。若硬下疳一发现,即用有效药物及时治疗,杀死患者体内的全部螺旋体。这样,局部和血液都不存在有螺旋体,亦即感染与免疫同时终止。如此时患者再次感染,则其病程重新从Ⅰ期硬下疳开始。
  苍白亚种螺旋体侵入机体后,可被中性粒细胞和巨噬细胞吞噬,但不一定被杀死。只有当特异性抗体形成后,并在补体协同下,才能使吞噬加强并具杀伤作用。根据近来研究,表明在梅毒免疫中,细胞免疫比体液免疫重要。从实验资料发现,Ⅰ、Ⅱ期梅毒病变中的细胞因子类型呈现典型的Th1细胞免疫应答,同时亦有CD8CTL参与。
  微生物学检查法
  1.标本  Ⅰ期梅毒取硬下疳渗出液,Ⅱ期梅毒取梅毒疹渗出液或局部淋巴结抽出液。
  2.显微镜检查  新鲜标本可加盖玻片后,立即在暗视野显微镜下检查。苍白亚种螺旋体呈现活泼的运动,沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等。亦可将标本与荧光标记的苍白亚种螺旋体抗体结合后,在荧光显微镜下观察;或用ELISA法,在普通光学显微镜下检查。
  3.血清学诊断  人体感染苍白亚种螺旋体后,除产生特异性抗体外;还产生一种称为反应素(reagin)的抗体。反应素的来源有两种假说:①苍白亚种螺旋体表面存在的脂质所引起;②苍白亚种螺旋体破坏宿主细胞,由细胞释放的脂质所引起。因此,梅毒血清学试验有非密螺旋体抗原试验和密螺旋体抗原试验两类。
  ⑴非密螺旋体抗原试验:用正常牛心肌的心脂质(cardiolipin)作为抗原,测定患者血清中的反应素(抗脂质抗体)。最常用的有VDRL试验和RPR试验。
  VDRL试验(veneraldiseaseresearchlaboratory)试验是1946年美国性病研究实验室创建的,故以该实验室命名之。原理是以胆固醇为载体,包被上心脂质,构成VDRL抗原微粒。当与血清中的反应素结合,就相互粘附形成凝集,是为阳性反应。不发生凝集者,为阴性反应。试验在玻片上进行,可以定性或半定量,结果需用10×10低倍显微镜观察。
  RPR试验(rapidplasmareagin)是VDRL试验的改良。原理是用未经处理的活性炭颗粒(直径3-5μm)吸附VDRL抗原。此颗粒若与待检血清中的反应素结合,便形成黑色凝集块,肉眼即可识别,不需低倍镜观察。试验在专用纸卡的反应圈(内径18mm)内进行,亦可以定性或半定量。
  VDRL和RPR两种试验适用于大量过筛时使用。由于它们采用的是非密螺旋体抗原,而反应素亦可以在非密患者血清中出现,例如风疹水痘等病毒性感染,类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病,麻风疟疾,以及吸毒者,妊娠、甚至个别健康人也可呈生物学假阳性。同时,对这类敏感性很高、特异性较差的非密螺旋体抗原试验的结果分析和判定时,必须结合临床资料。
  ⑵密螺旋体抗原试验:采用Nichols株螺旋体作为抗原,测定血清中的螺旋体特异抗体,特异性强,可用作梅毒证实试验。常用的有FTA-ABS试验和MHA-TP试验。
  FTA-ABS(fluorescenttreponemalantibody-absorption)试验是一种间接荧光抗体检测方法。原理是先用Reiter螺旋体吸收去患者血清中可能存在的螺旋体杂抗体后,滴加到已吸附有Nichols株螺旋体的玻片反应圈内;然后再加入异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG(FITC-抗人IgG)。若待检血清中有密螺旋体抗体,就会结合在玻片上固着的Nichols螺旋体上;随后加入的FITC-抗人IgG抗体,又与结合在螺旋体上的抗体作用。因而,在荧光显微镜下可观察到发荧光的Nichols螺旋体。
  MHA-TP(microhemagglutinationassayforantibodiestoTreponemapallidum)试验是一种微量间接血凝试验。原理是先用Reiter螺旋体吸收去患者血清中非密螺旋体抗体后,以Nichols株螺旋体提取物致敏的羊或鸡红细胞加入之。若待检血清中有密螺旋体抗体存在,则致敏红细胞与之结合后,在微量血凝板上形成散在的红细胞凝集细片,是为阳性反应。反之,待检血清不存在密特异抗体时,致敏红细胞不发生凝集,这些未凝集红细胞沉降于血凝板孔底部,呈现致密小红斑,则为阴性反应。
  密螺旋体抗原试验的特异性虽强,但仍不能区分雅司、品他病和地方性梅毒。又脓皮病、痤疮、真菌病、银屑病、类风关、系统性红斑狼疮、妊娠、吸毒者等也可出现生物学假阳性。因此,这些试验的结果判定,仍需结合临床资料来分析。
  诊断先天性梅毒,应取脐血标本进行检测。当脐血的梅毒抗体效价明显高于母体时应疑及婴儿感染,俟后若效价恒定上升,则提示新生儿感染了梅毒。神经梅毒应检测脑脊液有无梅毒抗体的存在。
  近来,也可用PCR技术检测苍白亚种螺旋体的特异DNA片段,或用免疫印迹法测定与苍白亚种螺旋体特异抗原组分发生反应的特异抗体。
  防治原则  梅毒是一种性病,应加强性卫生教育和严格社会管理。梅毒确诊后,宜用青霉素等药物及早予以彻底治疗。
  二、其他密螺旋体
  密螺旋体属中与人类有关的尚有苍白密螺旋体地方亚种、极细亚种,以及品他密螺旋体,它们分别引起地方性梅毒、雅司和品他病。这些非性传播疾病大多发生于经济较落后地区的儿童。
  地方性梅毒,也称Bejel病(非性病性梅毒)。人与人间的传播是通过污染的食具。临床表现与梅毒很相似。Ⅰ期口腔病灶不易察觉。Ⅱ期损害有口咽部粘膜斑、口角开裂性丘疹、骨膜炎和局部淋巴结肿大等。Ⅲ期病变有皮肤和骨的慢性肉芽肿,可造成鼻的破坏性毁形。心血管和中枢神经系统罕有累及。
  雅司传播方式主要通过与感染皮肤病损的直接接触。临床表现类似梅毒。病程分三期,也有反复隐伏和再发的特点。Ⅰ、Ⅱ期主要是皮肤发生杨梅状丘疹,全身都有,以四肢和头部为多。Ⅲ期是皮肤、淋巴结和骨的破坏性病变。一般不侵犯心血管和中枢神经系统。
  品他病(pinta)主要危及皮肤。传播也是与病损皮肤的直接接触所致。1-3周潜伏期后,皮肤出现小的瘙痒性丘疹,遍及面、颈、胸、腹和四肢。继而扩大、融合,表面脱屑,是为Ⅰ期品他疹。3-12月后,出现Ⅱ期品他疹,色素变深。Ⅲ期品他疹常在感染后1-3年发生,主要表现为皮损部位色素减退,甚至消失呈白瓷色斑。最后皮肤结痂、变形。品他病不累及粘膜,无全身症状,晚期也不影响心血管和中枢神经系统。
  上述三种疾病的微生物学检查,可以从皮肤标本中直接在暗视野显微镜下,观察有无密螺旋体的存在。也可用梅毒血清学试验检测此血清中有无相应抗体的存在。由于苍白密螺旋体地方亚种、极细亚种和品他密螺旋体与苍白密螺旋体苍白亚种(梅毒病原体),在形态、抗原结构,甚至DNA同源性方面基本相同,无法将它们各个区别。因此,除微生物学检查中查见密螺旋体并梅毒血清试验阳性可辅助诊断为密螺旋体感染外,还必须结合临床表现,才能确定是哪一种密螺旋体感染。
    第二节  疏螺旋体属
  疏螺旋体属,亦称包柔螺旋体属。8-40μm长,0.2-0.5μm宽。有3-10个稀疏而不规则的螺旋,呈波状。其中部分对人类、哺乳动物或禽类有致病性。对人致病的主要有伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体,它们均通过吸血昆虫媒介而分别致莱姆病(Lymedisease)和回归热。
  一、伯氏疏螺旋体
  伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)是莱姆病的病原体。莱姆病最初于1977年在美国康涅狄格(Connecticut)州的莱姆镇发现,故名。5年后由Burgdorfer自硬蜱(Ixodex)体内分离出,并由Burgdorfer从患者分离培养证实。1985年我国在黑龙江省林区首次发现,1988年从病人血液分得病原体。迄今,我国已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。
  生物学性状
  1.形态与染色  疏螺旋体,长11-37μm,宽0.18-0.25μm。两端稍尖。运动活泼,有扭转、翻滚、抖动等多种方式。在培养基中,数个螺旋体可不规则地缠绕一起,呈卷圈状。超微结构医学.全在线www.med126.com中,根据菌种不同,,周浆鞭毛数自2-100根以上不等。周浆鞭毛与运动有关。革兰染色阴性,但不易着染。Giemsa或Wright染色均佳。
  2.培养  营养要求高,培养基需含有长链饱和与不饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸牛血清蛋白等。微需氧,5%-10%CO2促进生长。适宜温度为35℃。生长慢,在液体培养基中的分裂1代需18h,一般需培养2-3周始可观察到生长情况。在1%软琼脂固体培养基中的菌落常生长在近表面,呈细小、边缘整齐,直径0.40-0.45μm的菌落。
  3.分类  长期以来,认为莱姆病的病原体只有伯氏疏螺旋体一个种。近来,采用DNA同源性分析了世界各地分出的莱姆病菌株,发现引起莱姆病的疏螺旋体至少有3个种,且它们在各地的分布不尽相同。①伯氏疏螺旋体,主要是美国和欧洲;②伽氏疏螺旋体(B.garinii),欧洲和日本为主;③埃氏疏螺旋体(B.afelii),亦主要从欧洲和日本分离出。
  有学者应用SDS-PAGE分析了伯氏疏螺旋体国际代表株B31的蛋白图谱,将世界各地莱姆病分离株与之比较。发现美国菌株与B31株主要蛋白表型一致,而欧洲分离的绝大多数菌株明显不同于美国株。例如美国株都有外膜蛋白OspA,而欧洲株极少有OspA。研究表明,我国分离的大部分菌株的蛋白图谱更接近于欧洲菌株。
  有学者按不同菌株在基因组上的异质性,将常见的伯氏疏螺旋体分为3个基因种(genospecies):①基因种Ⅰ(代表株为B.burgdorferisensustricto,B31)②基因种Ⅱ(代表株为B.gariniisp.nov,20047)③基因种Ⅲ(代表株为Vs461)。
  又有学者应用单克隆抗体,对莱姆病病原体外膜蛋白OspA的不同表位进行血清型分类,认为可分成4种,除日本疏螺旋体(B.japonica)不感染人外,另3种B.burgdorferisensustricto,B.garinii和B.afzelii均可引起莱姆病。B.burgdorferisensustricto属于OspA血清1型;埃氏疏螺旋体属于OspA血清2型;而伽氏疏螺旋体有明显的异质性,病株分属于OspA血清3-7型。另有学者以其外膜蛋白OspC来分型,谓至少可将莱姆病分离株分成13个OspC血清型。
  鉴于莱姆病病原体存在着异质性,其分类尚未取得统一,现一般以伯氏疏螺旋体作为莱姆病病原体的统称。
  致病性与免疫性  莱姆病是一种自然疫源性传染病。储存宿主主要是野生和驯养的哺乳动物。啮齿类中的白足鼠,畜类中的鹿更为重要。主要传播媒介是硬蜱,已确定的有4种:美国的丹敏硬蜱、太平洋硬蜱;欧洲的蓖子硬蜱和亚洲的全沟硬蜱。病原螺旋体主要在蜱的中肠生长繁殖。当蜱叮咬宿主时,可通过染有病原体的肠内容物返流、唾液或粪便而罹患。除硬蜱外,也可能有其他吸血昆虫参与媒介。
  1.致病物质  伯氏疏螺旋体未发现有外毒素,其致病物质有粘附素等侵袭力和内毒素等。
  伯氏疏螺旋体具有粘附并侵入某些组织细胞的侵袭能力。将伯氏螺旋体加至人皮肤或成纤维细胞,可观察到螺旋体粘附、穿入并在成纤维细胞的胞质内生存。螺旋体也能粘附到人脐带静脉内皮细胞,并可被多价特异免疫血清或特异OspB单克隆抗体抑制。表明伯氏疏螺旋体表面存在有粘附素和入侵功能的物质,但其结构尚未完全确定。
  伯氏疏螺旋体的新分离株对小鼠毒力强,在人工培养基中传代多次后可丧失毒力。同时发现小鼠对螺旋体的抗吞噬能力也大为减弱,外膜蛋白OspA亦随之消失。OspA可能与抗吞噬有关。
  伯氏疏螺旋体细胞壁中有LPS组分,具有内毒素作用。
  2.所致疾病  人被疫蜱叮咬后,伯氏疏螺旋体在局部繁殖。经3-30d潜伏期,在叮咬部位可出现一个或数个慢性移行性红斑(erythemachronicummigrans,ECM)。开始时为红色斑疹或丘疹,随后逐渐扩大形成一片大的圆形皮损,外缘有鲜红边界,中央呈退行性变,故似一红环;也可在皮损内形成几圈新的环状红圈,似枪靶形。皮损逐渐扩大,可达直径5-50cm。一般经2-3周,皮损自行消退,偶留有斑痕与色素沉着。早期尚可有乏力、头痛发热、肌痛等。未经治疗的莱姆病病人,约80%可发展至晚期,时间快慢不一,快的在发病后1周内出现,慢的可超过2年。晚期主要表现为慢性关节炎、慢性神经系统或皮肤异常。莱姆病患者的个体差异明显,轻者可为亚临床感染或仅累及一个系统,重者可同时出现皮肤、神经系统、关节、心脏等多脏器损害。任何一个系统的受累均可呈暂时性、再发和慢性化特点。不同地区可有不同临床特征,如在美国,关节炎较多见,而欧洲则以神经系统改变更常见,此可能与不同菌株有关。
  3.免疫性  当移行性红斑形成后,皮损中的伯氏螺旋体数量不多,这已由分离培养和PCR技术予以证实。在晚期,临床标本亦难以分离出螺旋体。因此,菌量如此少却能使疗程持续进展深受学者注目。
  有报道谓伯氏疏螺旋体进入宿主体后,能激发巨噬细胞等使之产生IL-1、IL-6和TNF等细胞因子;亦能活化补体替代途径,释放C3a、C5a等炎症介质。促使炎症的发生,既造成机体的损伤,但亦有对宿主有益的免疫防御作用。
  伯氏螺旋体的抗原性比较稳定,在体内形成的特异性抗体是清除它们的主要免疫机制。
  微生物学检查法  由于伯氏疏螺旋体在莱姆病的整个病程中数量较少,因此直接镜检和分离培养一般不做,主要依靠血清学试验和分子生物学技术来诊断莱姆病。
  使用最广泛的是免疫荧光法和ELISA。因ELISA在莱姆病的各期均较敏感和特异,更受到选用。IgM抗体在移行性红斑出现后2-4周形成,6-8周达峰值,一般在4-6月后恢复正常。在持续性感染患者,IgM保持高水平。IgG抗体出现较迟,其峰值在发病后4-6月,并持续至病程的晚期。若脑脊液中查有特异抗体,表示中枢神经系统已被累及。
  ELISA阳性时,需用蛋白印迹分析其特异性。IgM抗体的主要靶抗原是41kDa的鞭毛抗原,IgG抗体的靶抗原则为31kDaOspA、34kDaOspB、21kDaOspC和60kDa热休克蛋白。
  由于伯氏疏螺旋体与苍白密螺旋体等在抗原结构上有共同部分,生物学假阳性难以避免。又引起莱姆病的螺旋体不只一种,特异靶抗原随不同菌株而异。因此,ELISA和蛋白印迹分析所得结果,仍需结合临床资料判定。近来又有试用更特异的PCR技术,来检测疏螺旋体特异DNA进行莱姆病诊断的。
  防治原则  疫区工作人员要加强个人保护,避免硬蜱叮咬。化学灭活全疫苗,1992年已获准在美国家犬中使用。研制中的人用侯选菌,主要是重组单一蛋白疫苗。研究最多的伯氏疏螺旋体OspA和OspC,存在的问题是OspA变异多。又缺乏OspA和OspB的伯氏疏螺旋体突变株,在动物实验中亦可产生保护性免疫。
  二、回归热疏螺旋体
  回归热是由多种疏螺旋体引起的急性传染病。其临床特点为急起急退的高热,全身肌肉酸痛,1次或多次复发,肝、脾肿大,重症可出现黄疸和出血倾向。根据回归热传播媒介昆虫的不同,可分为两类。一为虱传回归热,或称流行性回归热,其病原体为回归热疏螺旋体(B.recurrentis)。另一为蜱传回归热,又称地方性回归热,其病原体多至15种,例如杜通疏螺旋体(B.duttonii)、赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)等。我国流行的回归热主要是虱传型。
  流行性回归热主要通过人体虱在人类中传播。当虱吸吮病人血液后,螺旋体从中肠进入血淋巴大量繁殖,不进入唾液或卵巢。人被虱叮咬后,因抓痒将虱压碎,螺旋体经皮肤创伤进入人体。螺旋体在人血流中大量繁殖,数量可高达10万条/mm3。患者高热,持续3-4d后,热退;隔1周左右,又高热。如此反复发作3-9次,亦有多达14次者。其机制是螺旋体外膜蛋白易发生变异之故。
  蜱传回归热主要通过软蜱传播,储存宿主是啮齿类动物。螺旋体在蜱的体腔、唾液、粪便内均可存在,且经卵传代。故蜱叮咬人后,病原体可直接从皮肤创口注入体内。蜱传回归热的病程和临床表现与虱传型相似,只是病程较短、症状较轻。
  回归热的免疫机制主要是以特异性抗体为主的体液免疫。当第一次高热消退前,患者血清中已出现特异的IgM类抗体。这些抗体与补体协同作用可裂解螺旋体,清除血流中的螺旋体。但隐匿在内部组织的螺旋体,其外膜蛋白可因编码基因重排形成新的突变株,逃逸初次感染病原体特异抗体的攻击。当这些突变株繁殖至一定数量,则引起第二次高热。如此多次,直至螺旋体的突变类型不再超越宿主产生的多种特异性抗体的范围为止。
  回归热的微生物学检查法主要采取发热期血液,直接涂片后进行Giemsa或Wright染色,在光镜下可查见比红细胞长数倍的螺旋体。
  三、奋森疏螺旋体
  奋森疏螺旋体(B.vincentii)的形态与回归热疏螺旋体类似。正常情况下,与梭形梭杆菌(Fusobecteriumfusiforme)寄居于人类口腔牙龈部。当机体免疫功能下降,则这两种菌大量繁殖,协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、口腔坏疽等。
  微生物学检查法可采取局部病变材料,直接涂片,革兰染色镜检。可观察到螺旋体和梭杆菌并存,两者均呈革兰阴性反应。
    第三节  钩端螺旋体属
  钩端螺旋体的螺旋较密螺旋体的更多、更细密而规则,一端或两端弯曲钩状,故名。
  钩端螺旋体属细菌很多,可分为两个种。Ⅰ种为问号状钩端螺旋体(L.interrogans),对人致病的属于此种。Ⅱ种为双曲钩端螺旋体(L.biflexa),为腐生性菌,对人不致病。
  一、生物学性状
  形态与染色  大小0.1-0.2×6-12μm.。螺旋细密、规则,形似细小珍珠排列的细链。一端或两端呈钩状。运动活泼,常使菌体呈C、S或8字形。
  钩端螺旋体的最外层为外膜,其内为螺旋状的肽聚糖层和细胞膜包绕的圆柱状原生质。在外膜与肽聚糖层间有两根周浆鞭毛,每根各自菌体一端伸展至中央但不重叠。
  革兰染色阴性,但不易着染。常用Fontana镀银染色法,钩端螺旋体被染成棕褐色。
  培养特性  需氧或微需氧。营养要求复杂,常用Korthof培养基,内含基本成分外,尚需加10%兔血清或牛血清。血清除促进钩端螺旋体生长外,尚有中和其代谢过程中产生的毒性物质。适宜生长温度为28-30℃,若11-13℃能生长的为非致病的双曲钩端螺旋体。最适pH7.2-7.6,<pH6.5死亡,最高能耐pH8.4。
  钩端螺旋体在人工培养基中生长缓慢。在液体培养基中,分裂一次需6-8h;28℃孵育1-2周,液体培养基呈半透明云雾状生长。在固体培养基上,经28℃孵育1-3周,可形成透明、不规则、直径<2mm的扁平细小菌落。如将琼脂浓度减至0.8%-1.0%,则3-10d孵育后,在培养基表面下形成针尖大小的半圆形菌落。
  抵抗力  钩端螺旋体对热抵抗力弱,60℃1min即死亡。0.2%来苏、1:2000升汞、1%石炭酸经10-30min被杀灭。对青霉素敏感。在湿土或水中可存活数月,这在传播上有重要意义。
  分类
  1.抗原分类
  ⑴属特异性抗原(genus-specificproteinantigen,GP-AG):只存在于钩端螺旋体属中,细丝体属无此抗原。故GP-AG有助于钩端螺旋体病的血清学诊断,也可用于钩端螺旋体科的分类.
  ⑵群特异性抗原(serogroup-specificantigen):系菌体类脂多糖复合物。
  ⑶型特异性抗原(serovar-specificantigen):系表面抗原,为多糖蛋白复合物。
  应用显微镜凝集试验(microscopicagglutinationtest,MAT)和凝集素吸收试验(agglutinationabsorptiontest,AAT),可将钩端螺旋体属进行血清群和血清型的分类。目前问号状钩端螺旋体至少可分为25个血清群、273个血清型,其中有我国学者发现的237个血清型。迄今,我国已发现的致病性钩端螺旋体至少有19个血清群、74个血清型,是发现血清型最多的国家。
  2.DNA分类  应用DNA杂交技术对不同钩端螺旋体株进行DNA同源性分析,可将腐生性的双曲钩端螺旋体分成3个基因种,致病性的问号状钩端螺旋体分成7个基因种。
  二、致病性与免疫性
  致病物质  钩端螺旋体具有类似细菌外毒素和内毒素的致病物质。
  1.内毒素样物质(endotoxin-likesubstance,ELS)或称脂多糖样物质(lipopolysaccharide-likesubstance,LLS)。钩端螺旋体的细胞壁中含有类似革兰阴性菌的脂多糖物质。经动物试验,其引起的病理变化与典型的内毒素相似,只是活性较低。重症患者表现的症状与病变亦与革兰阴性菌内毒素血症类同。这种ELS与革兰阴性菌的内毒素LPS,在结构上有一定差异。例如ELS缺乏2-酮-3脱氧辛糖酸(KDO),脂质A不含3-羟基豆蔻酸,这些可能与ELS的毒性较低有关。
  2.溶血素  波摩那型、犬型、七日热型等钩端螺旋体培养物上清液,有溶血素产生,能破坏红细胞膜而溶血。注射入小羊,可出现贫血、出血、肝肿大、黄疸和血尿。溶血素不耐热,56℃经30失活。对氧稳定,可被胰蛋白酶破坏。有认为溶血素的本质是鞘磷酶C。
  3.细胞毒性因子(cytotoxicityfactor,CTF)  钩端螺旋体患者急性期血浆中存在有一种CTF,将之注射小鼠,可出现肌肉痉挛、呼吸困难而死亡。症状与钩端螺旋体接种至金地鼠临死前的症状相同。钩端螺旋体无毒株不产生CTF。
  另发现致病钩端螺旋体能产生一种细胞致病作用(cytopathiceffect,CPE)物质。56℃经30被破坏。注射入家兔,可形成红斑和水肿
  所致疾病  钩端螺旋体病是一种人畜共患传染病。我国已从50多种动物中检出有致病性钩端螺旋体,其中以鼠类和猪为主要储存宿主,蛇、鸡、鸭、鹅、、兔等亦可能是储存宿主。
  动物感染钩端螺旋体后,大多呈隐性感染,不发病。但在肾脏中长期存在,持续随尿不断排菌,污染水源和土壤。人类与污染的水或土壤接触而受感染。钩端螺旋体也可通过胎盘垂直感染胎儿,导致流产;偶有经哺乳传给婴儿或吸血昆虫传播。
  钩端螺旋体纤细、运动极为活泼,能穿透完整的粘膜或经皮肤破损处进入人体。病原体进入后,即在局部迅速繁殖,并经淋巴系统或直接进入血循环引起菌血症。由于钩端螺旋体的血清型别不同、毒力不一,宿主免疫水平差异,临床表现轻重相差甚大。轻者似感冒,仅出现轻微的自限性发热;重者可有明显的肝、肾、中枢神经系统损害,肺大出血,甚至死亡。钩端螺旋体病的特点是起病急、高热、乏力、全身酸痛、眼结膜充血、腓肠肌压痛、表浅淋巴结肿大等。
  免疫性  致病性钩端螺旋体进入人体后,中性粒细胞不能吞噬病菌,单核-巨噬细胞可以吞噬。若病菌数量少、毒力低,病菌被完全或大部分杀灭,则感染不形成或呈隐性感染状态。发病后1-2周,随着特异性抗体的产生并逐渐增多,使吞噬细胞的吞噬和杀伤效率大为加强,血循环中的钩端螺旋体迅速被清除。但抗体等对侵入肾脏的病菌作用较小,它们能在肾小管等组织中继续有一定程度的繁殖和经尿排菌,一般排菌在半年左右。
  三、微生物学检查法
  病原体检测  发病10内取血液;1周后取尿液,有时可长达至3个月;有脑膜刺激者取脑脊液。
  1.直接镜检  将标本行差速离心集菌后作暗视野检查,或用Fontana镀银法染色后镜检。也可用免疫荧光法或免疫酶染色法检查。
  2.分离与鉴定  将标本接种至Korthof培养基,置28℃孵育。多数阳性标本在2周内可见培养液呈轻度混浊,然后以暗视野显微镜检查有无钩端螺旋体存在。若有,则用已知诊断血清诊断鉴定其血清群和血清型。分离培养标本应连续观察至4个月,仍无生长者始判定为阴性。
  3.动物接种  是分离钩端螺旋体的敏感方法,尤其适用于有杂菌污染的标本。方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接种3-5d后,可用暗视野显微镜检查腹腔液;亦可在接种后3-6d取心血检查并作分离培养。动物死后解剖,可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑,肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。
  4.分子生物学方法  采用同位素或生物素、地高辛标记的特异DNA探针法,其检出标本中钩端螺旋体的特异性、敏感性均优于培养法,且得出结果快速。若先用PCR技术将特异DNA片段先行扩增,再用探针确定,则灵敏度更可提高。例如单用DNA探针技术,可测出200条左右的钩端螺旋体,加用PCR扩增后,则少至10条病原体就可检出。
  血清学诊断  应采取病程早、晚期双份血清,一般在病初和发病后第3-4周各采一次。有脑膜刺激症状者采取脑脊液检测特异抗体。
  1.显微镜凝集试验(MAT)  或称凝溶试验。钩端螺旋体与相应的特异性抗体结合,可发生凝集现象,在暗视野显微镜下明显可见。但当补体效价高时,则在补体的参与下,出现溶解反应。MAT有较高的特异性和敏感性,但需用不同血清型别的活钩端螺旋体来作为已知抗原进行检测。
  2.间接凝集试验  以乳胶(聚苯乙烯)或活性炭微粒为载体,吸附钩端螺旋体可溶性抗原作为指示物。当这些以特异抗原致敏的载体与病人血清中的相应抗体结合后,就出现凝集现象,是为阳性反应。间接凝集试验结果可用肉眼直接观察。
  以上各项血清学试验有助于钩端螺旋体病的诊断。MAT抗体效价>1:300,炭粒凝集效价>1:8、乳胶凝集效价>1:2,可判为阳性。但若第2次采血测定效价呈4倍或以上增长者,临床意义更大。
  四、防治原则
  钩端螺旋体病是一种人畜共患病,要做好防鼠、灭鼠工作,以及加强对带菌家畜的管理。
  在常年流行地区,对易感人群和与疫水接触者宜接种包含当地流行株在内的多价钩端螺旋体疫苗。目前沿用的是多价全细胞死疫苗,只要疫苗株的血清型与流行株一致,有肯定预防效果。但因接种量大、接种需多次,而全菌中带有免疫预防无关的组分,因而有副反应较大等不足。为此,国内外均在研究新一代的钩端螺旋体疫苗。
  我国研制的钩端螺旋体外膜疫苗,经过动物保护试验、毒力试验和安全试验,皆获得满意结果。经志愿者试验,接种后无反应或反应极为轻微。免疫后1-3个月,血清特异抗体明显上升,持续时间长。以后,在此第一代外膜疫苗研究基础上,对培养基和生产工艺作了较大改进,制成了第2代外膜疫苗。动物试验表明,接种100μg量即可获得保护作用。人体接种后,副反应轻微,一次免疫后特异抗体明显升高,免疫后3个月,抗体下降慢于全疫苗,提示第2代钩端螺旋体外膜蛋白疫苗可以替代传统的全疫苗,成为预防钩端螺旋体的较理想的新一代疫苗。
  其他研究中的新钩端螺旋体新疫苗,尚有以其LPS或LPS与白喉类毒素偶联物作为免疫原的。小鼠实验发现两者免疫后第4周出现特异抗体,6-8周时抗体效价达峰值,但LPS与白喉类毒素偶联物产生的抗体效价要比单独LPS的高15-100倍。表明钩端螺旋体LPS或与白喉类毒素偶联后,亦有可能成为预防钩端螺旋体病的侯选新疫苗,值得进一步深入研究。


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